基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组、试剂盒及方法技术

一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组、试剂盒和方法。检测引物组包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白、显色剂和对照。其检测方法是通过提取待检DNA，利用具有链置换活性的DNA聚合酶活性，采用四条特异性引物及一种错配结合蛋白，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，可检测到DNA的pg级，其鉴定方式是采用在反应体系中加入

Primer group, kit and method for detection of Vibrio parahaemolyticus based on intelligent constant temperature amplification

A primer group, kit and method for the detection of Vibrio parahaemolyticus based on the intelligent constant temperature amplification technique. Primer group includes TP primers and FP primer and BP primer and OP1 primer and OP2 primer; primer kit including liquid, Bst reaction liquid, DNA polymerase, mismatch binding protein, chromogenic agent and control. The detection method is tested by extracting DNA with strand displacement activity DNA polymerase activity by using four specific primers and a mismatch binding protein, 60~65 degrees in the sample DNA templates were amplified by PG DNA can be detected, the identification method is used to join in the reaction system

【技术实现步骤摘要】
基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrdopmrahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，发病呈世界性分布，人们食用受该菌污染的食物后会引起腹泻、肠痉挛、呕吐等，重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。副溶血弧菌是进出口水产品检测的重要项目，在饮用水、食品检测和食品中毒源调查、传染病源调查等工作中，也经常需要对该菌进行检测。以细菌培养为基础的传统生化鉴定方法，费力耗时、结果提供不及时，有时结果不准确。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的鉴定方法，如PCR-SSCP，PCR-RFLP，DNA探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐，但对检测人员技术水平要求高、仪器昂贵、检测周期长，为满足快速鉴别分类的需求，为科学研究提供快速方便的方法，缩短副溶血弧菌鉴别时间，降低鉴别技术难度和费用一直是相关研究的热点。所以，在食品检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一方面，本专利技术公开了一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAATCCGCTCTACAACTGGTP引物：CTGGGCAGTTGTTAGCGCGATGTATTGGTCBP引物：CGGCGCGGCTGGTGOP1引物：TTGCCAAAGCGAAGAACCOP2引物：ACTTGATCACCAACCCCT。优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。另一方面，本专利技术还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。优选地，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMgSO4，0.2％优选地，阳性对照为含有副溶血弧菌tlh/ldh基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含副溶血弧菌tlh/ldh基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的GreenI。再有，本专利技术还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的方法，包括如下步骤：(1)待检样品DNA的提取；(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于60-65℃反应20-40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl22.5mmol/L、KCl10mmol/L、MgSO42mmol/L、GreenI0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl20mmol/L、0.2％6UBstDNA聚合酶、1μgTapMuts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。本专利技术的基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的方法可以通过本专利技术方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本专利技术的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。从原理上讲，本专利技术以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别副溶血弧菌的引物组、试剂盒和方法。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。因此，结合上述原理及本专利技术实施例中的技术效果可知，本专利技术至少包含如下有益效果：本专利技术根据目标序列保守区域设计turnbaekprimer(TP)、forwardprimer(FP)、boostprimer(BP)、outerprimer1(OP1)、outerprimer2(OP2)共5条引物，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，它们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，由实时荧光定量PCR仪监测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低I值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在60～65℃恒温条件下20-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩增无法识别DNA片段中的突变点而难以实现基因多态性的检测，而阻碍了恒温扩增技术在基因多态性检测领域的推广。另外，智能恒温扩增技术与传统的检测基因多态性的方法，如DNA芯片、限制性片段长度多态性PCR、等位基因特异性多PCR，DNA测序，TaqMan探针、Invader等相比，其主要优势在于恒温反应这一特性决定了智本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAATCCGCTCTACAACTGGTP引物：CTGGGCAGTTGTTAGCGCGATGTATTGGTCBP引物：CGGCGCGGCTGGTGOP1引物：TTGCCAAAGCGAAGAACCOP2引物：ACTTGATCACCAACCCCT。

【技术特征摘要】
1.一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:FP引物：TTTATATATATATAAATCCGCTCTACAACTGGTP引物：CTGGGCAGTTGTTAGCGCGATGTATTGGTCBP引物：CGGCGCGGCTGGTGOP1引物：TTGCCAAAGCGAAGAACCOP2引物：ACTTGATCACCAACCCCT。2.如权利要求1所述的基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。3.一种基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。4.根据权利要求3所述的基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述错配结合蛋白为TapMuts错配结合蛋白。6.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mMdNTPs、10％DMSO、40mMTris-HCl(pH8.8)、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、16mMMg...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，石磊，闫鹤，陈洵，常彦磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44