一种长片段DNA体外重排的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种长片段DNA体外重排的方法。本发明专利技术利用改善的Cre‑LoxP系统的特异性重组技术，大大提高了长片段DNA重排的效率，以数量庞大的长片段DNA发生重排的质粒文库为基础，将质粒文库导入到对应的宿主细胞验证其最佳的表型，进而确定重排后的长片段DNA序列，可以广泛应用于基因重排、文库构建和代谢通路优化领域。

A method of rearrangement of long segment DNA in vitro

The invention relates to the field of biological technology, and specifically discloses a method for the in vitro rearrangement of a long fragment of DNA. The invention uses Cre LoxP system to improve the specificity of the recombinant technology, greatly improving the efficiency of DNA long fragment rearrangement of the plasmid library with long fragment DNA large number of rearrangements based the plasmid library into the corresponding host cells to verify the optimal phenotype, and then determine the long fragment DNA sequence after rearrangement and can be widely applied in gene rearrangement, library construction and metabolic pathway optimization.

【技术实现步骤摘要】
一种长片段DNA体外重排的方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种长片段DNA体外重排的方法。
技术介绍
DNA重排是目前为止最简便、最有效的体外定向进化技术，从操作的对象来看，DNA重排主要可分为单一基因重排、家族基因重排、生物代谢途径基因重排等。(1)单一基因重排：目前，利用DNA重排技术已经成功对许多单一基因如工业用酶、抗体以及一些蛋白质等进行了定向改造，使酶活性、底物特异性以及抗体亲和性、蛋白质的功能、稳定性等得到了明显提高。由于它构建的是重组库，其效率一般要显著高于构建随机库的易错PCR。与定点突变相比，DNA重排不依赖于目前尚难以得到的特定蛋白质的结构与功能关系信息。(2)家族基因重排：当用DNA重排技术对单一基因进行改造时，多样性来源于PCR过程中引入的随机点突变。由于绝大多数点突变都是有害的或中性的，因此随机突变频率必须非常低，目的功能的进化比较缓慢。但自然进化产生的同源序列由于有害突变在漫长的进化过程中已经被淘汰掉了，因此富含“功能性”的多样性。利用这些自然进化产生的家族同源基因序列作为起始模板，进行DNA重排，可以迅速地将来源于不同种属的DNA组合在一起，从中筛选得到不同序列的优势组合的可能性大大增加。(3)生物代谢途径的改造：长期以来，人类一直利用微生物生产许多小分子药物如抗生素、抗真菌剂、杀虫剂、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂、心血管药物等。在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点,在基因工程领域得到了广泛的应用。位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体，并发生DNA链的切割与交换，实现靶位点之间的整合、切离或倒位。这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击，形成共价中间体，不需要高能量辅助因子的参与。目前，位点特异性重组酶做为工具酶的体外应用主要有Creator系统和基于λ整合的Gateway系统。Gateway系统在Int和IHF的作用下attB和attP发生重组，再加入Xis即发生attL和attR之间的逆向重组。利用这一原理和一对突变的位点，Hartley等人设计了通过两步克隆高效快速构建表达载体的Gateway系统。同时其载体上均带有自杀基因ccdB，宿主只有正确重组克隆转入后才能生长,方便筛选。Creator系统设计类似Gateway系统，二者均应用于基因克隆和表达，但仅能针对单个基因进行功能性研究。因此，亟待开发一种可以针对多个基因功能联合研究的体外随机重组方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种长片段DNA体外重排的方法，使得所述方法能够实现含多个基因的长片段DNA的随机组合，丰富基因重排的多样性，高效快速实现多个功能基因的联合分析，提高分析效率。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种长片段DNA体外重排的方法，包括：步骤1、在包含2个以上功能基因的长片段DNA的每个功能基因的5’和3’两端，各插入一段SEQIDNO:1所示核苷酸序列，获得待重排的长片段DNA；步骤2、将待重排的长片段DNA连接到带有筛选标签的质粒上，获得待重排的质粒；步骤3、将待重排的质粒、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合后开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得DNA重排的质粒文库；步骤4、将DNA重排的质粒文库转化到出发菌株并进行培养，以出发菌株为对照，选择菌落较大、颜色和对照菌落成显著差异的菌落作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒，对质粒上的重排后的长片段DNA进行分析。Cre/loxP重组酶系统常用于基因打靶，其中的LoxP位点来源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列确定了LoxP的方向，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，当两个loxP方向一致时，位于两个loxP中间的序列只能发生删除；当两个loxP方向相反时，位于两个loxP中间的序列只能发生反转，当两条DNA间的loxP发生重排时会导致两条DNA发生移位。本专利技术调整LoxP位点8bp的间隔序列ATGTATGC为ATGTACAT，使间隔序列消除了方向性，没有方向的loxP位点(SEQIDNO:1所示核苷酸序列)，删除、翻转、移位、复制等情形不必局限于之前的限制，均有几率发生，可大大增加重排组合的多样性。借助该特性，可实现含多个基因的长片段DNA的随机组合，获得数量庞大的基因组发生重排的质粒文库，再将质粒文库导入到对应的宿主细胞培养，从而产生多样化的表型特征，如菌落的大小表型和颜色表型，一般选择菌落较大、颜色和出发菌株有显著差异的作为潜在优势表型菌株，然后通过表型和基因型的关联分析，获得优化构建策略。所述长片段DNA由于含有功能基因，其一般都会带给菌株一些能力，所述潜在优势表型菌株一般指代可能具备较高这种能力的菌株，以由tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功能基因组成的长片段DNA为例，其能够使酵母菌株生产β-胡萝卜素，则潜在优势表型菌株在生产β-胡萝卜素上可能具备高产量能力。为了增加重排组合的多样性，SEQIDNO:1所示核苷酸序列插入到长片段DNA上每个功能基因的5’和3’两端，在本专利技术具体实施方式中，本专利技术以由crtE、crtI、crtYB、tHMG1四个功能基因顺次拼接的长片段DNA为例，在其每个功能基因的5’和3’两端(即tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功能基因5’和3’两端)，各插入一段SEQIDNO:1所示核苷酸序列，作为待重排的长片段DNA，然后再连接到带有筛选标签的质粒上，见图1。上述所选定的长片段DNA的功能是产生酵母菌株生产β-胡萝卜素的各种酶，故该长片段DNA带给酵母菌株的能力为生产β-胡萝卜素，而筛选潜在优势表型的酵母菌株就是通过菌落和颜色等表型，不经复杂的分析过程直接从丰富的文库中筛选获得，从而寄希望于能够筛选β-胡萝卜素产量较高的菌株，通过表型和基因型的关联分析，获得生产β-胡萝卜素优化构建策略。因此，本专利技术步骤4为：将DNA重排的质粒文库转化到出发酵母菌株中并进行培养，以出发酵母菌株为对照，选择菌落较大、颜色为与对照菌落形成显著差异的橙色或黄色的菌落，作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒并反转至大肠杆菌中，从大肠杆菌中提取质粒，利用实时定量荧光PCR或第三代测序技术对质粒上重排后的长片段DNA进行分析。其中，所述长片段DNA由tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长片段DNA体外重排的方法，其特征在于，包括：步骤1、在包含有2个以上功能基因的长片段DNA的每个功能基因的5’和3’两端，各插入一段SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，获得待重排的长片段DNA；步骤2、将待重排的长片段DNA连接到带有筛选标签的质粒上，获得待重排的质粒；步骤3、将待重排的质粒、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得DNA重排的质粒文库；步骤4、将DNA重排的质粒文库转化到出发菌株并进行培养，以出发菌株为对照，选择菌落较大、颜色和对照菌落成显著差异的菌落作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒，对质粒上的重排后的长片段DNA进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种长片段DNA体外重排的方法，其特征在于，包括：步骤1、在包含有2个以上功能基因的长片段DNA的每个功能基因的5’和3’两端，各插入一段SEQIDNO:1所示核苷酸序列，获得待重排的长片段DNA；步骤2、将待重排的长片段DNA连接到带有筛选标签的质粒上，获得待重排的质粒；步骤3、将待重排的质粒、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得DNA重排的质粒文库；步骤4、将DNA重排的质粒文库转化到出发菌株并进行培养，以出发菌株为对照，选择菌落较大、颜色和对照菌落成显著差异的菌落作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒，对质粒上的重排后的长片段DNA进行分析。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述筛选标签为营养缺陷标签或抗性标签。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述营养缺陷标签为氨基酸缺陷标签。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述氨基酸缺陷标签选自URA、LEU和HIS。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述抗性标签选自KanMX、NAT和Hyg。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：在由tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功能基因组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，吴毅，朱瑞莹，马璐，刘瑞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12