本发明专利技术公开了属于生物医药技术领域的一种肿瘤凋亡诱导配体蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术公开两个肿瘤凋亡诱导配体基因寡核苷酸序列，核苷酸序列分别如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示。本发明专利技术还公开了上述基因表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Ｔｒａｉｌ及其在制备治疗肿瘤细胞的药物中的用途。这一结果对于开发有效的治疗肿瘤的药物具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及在制备抗肿瘤药物中应用的肿瘤凋亡诱导配体基因和其表达的一种肿瘤凋亡诱导配体蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
肿瘤是危害人类健康的重大疾病，已经成为当今危害人类健康和死亡率最高的疾病。至今还没有有效的治疗肿瘤的药物。80年代发现的TNF，成为科研单位当时研究的热点，也为商家投资热点。但是由于TNF副作用太大而无法临床应用。目前使用的干扰素、胸腺肽、白介素II等只是辅助治疗肿瘤的药物。Trail是TNF-related apoptosis-inducing ligand(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)的缩写，也称为Apo-2L。是Wiley 1995年首次克隆成功的一种新的抗肿瘤细胞因子，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的一个成员。人TRAIL蛋白编码281个氨基酸，它的基因位于染色体3q26。Trail与目前发现的TNF家族的其它主要成员，如TNF-α，TNF-β(也称为淋巴毒素或LT-α)，淋巴毒素-β(LT-β)，41BBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也称为Apo-1L)等配体均为II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚体，参与调节机体内的许多重要生物功能。Trail除了在免疫调节和炎性反应方面起重要的作用外，还与TNF家族中的TNF-α、TNF-β、Fasl配体可导致肿瘤细胞凋亡。Trail与这些配体的区别在于，除可特异性导致肿瘤细胞发生凋亡外，不损伤正常细胞。这些细胞因子的跨膜受体含有死亡结构阈，与配体结合导致引起凋亡的一系列蛋白酶反应。Trail因具有强大的导致肿瘤细胞调亡，而使正常细胞逃逸它的杀伤作用，是一种理想的抗肿瘤和治疗病毒感染的生物活性因子。这一特性预示着其在治疗肿瘤患者和病毒感染中的广泛应用前景而受到关注。因为Trail具有强大的导致肿瘤细胞调亡，而使正常细胞逃逸它的杀伤作用，这一特性预示着其在治疗肿瘤患者和病毒感染中的广泛应用前景而受到关注。世界上不少实验室已经开始进行Trail基因工程新药的研究，但是目前均处于临床前研究阶段。我国上海第二军医大学也从事Trail的基因工程新药研究。经调查，这些实验室均是以Trail原形分子为开发对象。但是TRAIL是受专利严格保护，难以模仿生产。据我们检索数据看，目前在美国已经申请TAIL的相关专利5项。1.US 6284236“T Cytokine that induce apoptosis”2.US 6362801“T Nucleic acid encoding tumor necrosis factorreceptor”3.US 6214680“T Human tumor necrosis factor receptor”4.US 6072047“T Receptor that binds Trail”5.US 6363223“T DNA encoding a cytokine that induce apoptosis”上述专利文件4和5的专利技术人选定CVFF力场，利用DISCOVER-3程序包(如专利文件4所示)，对模建蛋白进行分子力学优化(如专利文件5所示)，在分子力学方法下经过18000步、20000步、15000步(收敛判据0.5kcal/mol)，依次通过最陡下降、共轭梯度(Polak-Ribiere方法)、牛顿力学(Broyden、Fletcher、Goldfarb、Shanno方法)依次进行能量优化；得到的构型，经过常温分子动力学动态模拟，搜索其构象空间，经分子力学优化得到常温稳定三维立体结构。分子力学方法通过适当力场下分子能量的计算与构象调整，优化初始分子结构。考虑到蛋白质分子的柔性，必将使其存在各种旋转位垒，分子力学方法下无法获得蛋白质分子整个构象空间中的能量最低构象。最近发展的分子动力学方法，克服了上述缺点，在经典力场下搜索其构象空间得到能量最小的优势构象。分子动力学模拟以成为研究蛋白质、核酸结构与功能的有力工具。对于蛋白质与受体间相互作用的理解和研究是合理进行蛋白质工程研究的必不可少的步骤，通过蛋白质分子间存在的相当显著的空间及电荷的互补性，利用分子对接(docking)方法研究蛋白质与受体的作用机制、直观考察蛋白质与受体结合部位空间上的互补性、计算相互作用能量。要把TRAIL作为抗肿瘤和病毒感染药物开发研究，首先必须研究具有自己知识产权的、并且具有强大细胞毒作用的突变型TRAIL分子结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肿瘤凋亡诱导配体蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。实现本专利技术目的的技术方案为肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail是TNF-related apoptosis-inducingligand(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)的缩写，也称为Apo-2L，肿瘤凋亡诱导配体蛋白是通过同源模建方法表达构建的TRAIL-R三维结构。是利用Biosym公司的InsightII的HOMOLOGY程序包，通过同源模建方法，选取的同源蛋白为已知的人TRAIL受体三维晶体结构(PDB库号1d0g，X射线晶体结构数据，分辨率为0.24nm)，运用BLAST、FASTA方法，通过序列比较确定保守区(SCR)及环区(Loop)，为TRAIL-R相应的氨基酸序列赋坐标，经过初始结构的调整，得到TRAIL-R的初始三维结构。提供的一种肿瘤凋亡诱导配体基因，由843个碱基组成，核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。提供另一种肿瘤凋亡诱导配体基因，由414个碱基组成，核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。提供上述基因表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail在制备治疗肿瘤细胞的药物中的用途。本专利技术的有益效果是TRAIL的突变、表达和基因工程开发研究，将为我国肿瘤治疗提供一种有效的治疗药物。由于其直接杀伤肿瘤的治疗效果和极小的副作用，其巨大的临床意义和经济效益将不可估量。我国人民因肿瘤死亡成为所有病因之首。按照肿瘤发病率为百分之零点六计算，我国患肿瘤人口就至少达800万人。如果能动员其中十分之一的肿瘤患者使用Trail，每个病人每年用药5个疗程，每个疗程用药20只计算，每年至少会消耗Trail注射剂8000万只。如果每只按照200元收费，其经济效益将不可估量附图说明图1为TRAIL与受体相互作用三维结构 aTRAIL三维结构；bTRAIL晶体结构图。图2为TRAIL突变体三维结构c突变体I的三维结构；d突变体II的三维结构；e突变体III的三维结构。图3为TRAIL突变体与其受体作用复合物三维结构空间图a突变体I与受体作用复合物三维结构；b突变体II与受体作用复合物三维结构。图4为工程菌构建示意图。图5为不同突变的TRAIL核苷酸序列分析。图6为IPTG诱导融合蛋白表达结果1-5道分别为诱导表达2-6hr；第六为中低分子量Marker；由大到小依次为97，66，43，31，20，14.4KD。图7为亲和层析纯化TRAIL融合表达蛋白的SDS-PAGE检测1.纯化后TRAIL融合蛋白。2.TRAIL融合蛋白的表达。3.TRAIL蛋白。4.GST蛋白。5.中低分子量Marker。由大到小依次为97，66，43，31，20，14.4KD。图8为突变型Tr本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤凋亡诱导配体蛋白，其特征在于，所述肿瘤凋亡诱导配体蛋白由８４３个碱基组成，核苷酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘少君，关良，冯建男，时小燕，郑黎燕，刘农乐，邹民吉，阙海平，王国华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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