一种高效提取河豚毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化、极高效地提取生产纯度较高的河豚毒素的方法，其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。解决了目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵（高压液相仪）的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高达97‑99%，直接符合生物学研究和临床应用的要求。本发明专利技术的另一目的是提供了含有本法制备的河豚毒素产品的各种制剂。

A method for high efficiency extraction of tetrodotoxin

The invention relates to a method of extracting tetrodotoxin with high purity and high efficiency by using puffer fish viscera as raw material, and its product can be used for detoxification, analgesia and antihypertensive drug preparations. To solve the current methods of extraction and purification of tetrodotoxin is various, but these methods are more or less there are some defects, such as high performance liquid chromatography with high purity of the output there are also expensive equipment (high pressure liquid chromatography) problems, and such as impregnation fractionation has lower efficiency, the product purity is not high, provides a method for large-scale extraction and preparation of tetrodotoxin, this method has the advantages of simple process, high efficiency, high yield, good quality, high product purity up to 97 99%, directly in line with the biological research and clinical application requirements. Another purpose of the present invention is to provide various preparations containing the tetrodotoxin product prepared by this method.

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取河豚毒素的方法
本专利技术涉及一种化学物质提取领域，尤其涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化、高效地提取生产河豚毒素的方法。其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种由河豚鱼内脏提取的低分子量生物碱类物质。由于其独特的化学结构使其成为细胞钠离子通道专一阻断剂。因此其在生物学研究领域作为生物试剂有着不可替代的位置。河豚毒素在医学临床上所显示的药理学作用，早在上世纪30年代就已有用于临床介断生物碱类成瘾性病症的报道。在镇痛治疗方面也不断有报道推出。因此，其无论在生物学研究领域还是在医学临床应用方面，都显示了十分重要的地位。TTX是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX的活性基团是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羟基，胍基在生理pH值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。钠离子受体至少有6个特异性靶分子结合位点，TTX是与钠通道受体部位I结合。TTX受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，TTX特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，TTX对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。TTX由于在极微量的情况下就能阻断细胞钠离子的通道，而对钾离子通道没有影响，具有高度的转移性，因此是十分有用的神经生理研究用工具药。临床医学上已证明TTX是良好的镇静剂、解痉剂、镇痛剂，特别对癌症等恶性疼痛具有良好的镇痛作用，与传统的杜冷丁、吗啡等镇痛药相比虽然响应时间稍长，但其镇痛作用可达12-20小时，而且无成瘾性。近来TTX在戒毒方面也显示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射10μgTTX一针，5-7天为一个疗程，毒瘾即可得到控制，并可大大减轻一般戒毒中常常出现的戒毒综合症。但河豚毒素注射液(水溶液)对温度很敏感，容易受温度的影响而发生降解，温度越高，降解越快。一旦有效活性物质河豚毒素含量低于其标示量的90％或有关物质的相对含量超过医药标准规定限度(大于对照溶液主峰面积)就不符合临床使用要求。试验证明，河豚毒素注射液(水针剂)在室温下不稳定，为了保证河豚毒素注射液的质量，防止河豚毒素含量下降和有关物质含量升高，必须将其置于4-8℃冰箱中保存。这就给河豚毒素的临床适用带来诸多困难和不便，相应在贮存、运输、装卸、批发、零售、医院和应用各个环节都得注意保持4-8℃低温，否则温度偏高可能影响临床效果，对此，必须设法尽快予以解决，研制出安全稳定，室温下就能长期贮存的可靠产品。为了解决上述问题，一个简单的做法是将河豚毒素做成冻干制剂。一般在水溶液中不稳定的生物活性物质在冻干脱水后贮存期都可延长，待临床应用时，加灭菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于医药时，其每剂量的用量只有0.5-60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中经冻干脱水后形成不了所要求的固态残留物，必需加入医药上能接受的赋形剂，才能提供微量河豚毒素得以附着的支架，在溶液冻干脱水后能形成固态物。虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题。中国专利局于2008年6月18日公开了一种河豚毒素制备方法的专利技术专利，授权公开号为CN101891751B，该专利技术专利采用氨基酸作助溶剂，不仅能起到助溶剂的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，还能与河豚毒素形成高水溶性的盐溶液，提供了一种生产纯度较高、杂质较少河豚毒素的方法，但该技术方案同样存在着制备周期过长、不宜用于大规模产业化生产等方面的缺陷。
技术实现思路
为解决上述虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高达97-99％，直接符合生物学研究和临床应用的要求。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种高效提取河豚毒素的方法，所述方法包括以下步骤：1)将河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡1-2小时，并以5800-6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行2-3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；2)微黄初毒液在低温条件下，用活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出大孔吸附剂，得到初毒液清液；3)对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积三分之一至二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行2-3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；4)对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再一次重复上述操作，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；5)对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液pH值调节至8.5-9.5，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；6)将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液pH值调节至8.5-9.5，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素。作为优选，所述步骤5)和步骤6)均优选为将pH值调节至9-9.2。作为优选，所述步骤1)中含醋酸的醇-水混合液中醇为甲醇、乙醇或两者混合醇，醋酸含量为0.8-1％，醇含量为10-12％，余量为水。作为优选，所述步骤1)中除脂液为氯仿、乙醚、苯、石油醚中任意一种物质。作为优选，所述步骤2)中的大孔吸附剂为D101大孔吸附剂或D201大孔吸附剂中的任意一种。作为优选，所述步骤3)中冷冻干燥分为三个阶段：(1)预冻2-3小时，温度为-20～-35℃；(2)低压干燥10-12小时，温度为-20～-25℃；(3)升温干燥3-4小时，温度为-5～5℃。作为优选，所述步骤3)中微滤施加压力为0.1-0.3MPa，优选为0.1-0.15MPa；超滤施加压力为0.1-0.3MPa，优选为0.2-0.25MPa；所述步骤4)中纳滤施加压力为0.1-0.3MPa，优选为0.1-0.15MPa。作为优选，所述步骤3)中减压浓缩在减压真空度为1.2-2.0Pa条件下进行；步骤5)中低温静置温度在10-35℃。作为优选，所述步骤6)中醋酸-甲醇-水体系中醋酸含量为0.5-0.8％，甲醇含量为8-10％，余量为水；低温减压干燥在压力0.01-0.02MPa，温度5～10℃条件下进行。上述方法是在水浴条件下提取，水浴温度优选为90-100℃，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效提取河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）将河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇‑水混合液搅拌浸泡1‑2小时，并以5800‑6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行2‑3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；2）微黄初毒液在低温条件下，用活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出大孔吸附剂，得到初毒液清液；3）对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积三分之一至二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行2‑3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；4）对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再一次重复上述操作，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；5）对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液pH值调节至8.5‑9.5，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；6）将河豚毒素结晶体溶于醋酸‑甲醇‑水体系溶液，利用氨水将溶液pH值调节至8.5‑9.5，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素。...

【技术特征摘要】
1.一种高效提取河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）将河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡1-2小时，并以5800-6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行2-3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；2）微黄初毒液在低温条件下，用活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出大孔吸附剂，得到初毒液清液；3）对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积三分之一至二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行2-3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；4）对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再一次重复上述操作，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；5）对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液pH值调节至8.5-9.5，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；6）将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液pH值调节至8.5-9.5，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素。2.根据权利要求1所述的一种高效提取河豚毒素的方法，其特征在于，所述步骤5）和步骤6）均优选为将pH值调节至9-9.2。3.根据权利要求1所述的一种高效提取河豚毒素的方法，其特征在于，所述步骤1）中含醋酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小军，陈思，曾军杰，卢义博，张勋，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，江苏美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33