本发明专利技术公开了一种重组的伪狂犬病毒Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰｒＶ）基因工程株ＷＫＱ－００１，保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｖ２００５１１的构建以及利用该毒株制备的伪狂犬病毒基因缺失标志灭活疫苗。本发明专利技术的毒株缺失了ＰｒＶ的糖蛋白基因ｇＩ、ｇＥ，因而可以作为标志基因，用于鉴别和诊断人工免疫猪及自然感染猪。本发明专利技术还涉及重组伪狂犬病毒株和基因缺失灭活疫苗的应用。与国外同类疫苗相比，其针对性更强，更加适合我国伪狂犬病的流行猪群；本发明专利技术的毒株来源于感染的猪，其灭活疫苗的安全性和保护性更适合于猪伪狂犬病的预防。同时本发明专利技术的基因工程株不含任何外源基因，因而具有更高的生物安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病毒学
，与基因工程有关。本专利技术具体涉及一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)突变株(毒株编号WKQ-001)的构建以及利用该重组的毒株制备伪狂犬病基因缺失标志灭活疫苗，本专利技术的毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，导致PrV毒力下降，因而可以用于制备伪狂犬病安全疫苗。本专利技术还涉及所述的重组伪狂犬病毒株和基因缺失灭活疫苗的应用。
技术介绍
伪狂犬病病毒(PrV)属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，具有在细胞培养物上快速生长，强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性(Roizmorn B，Desrosiers R，Flecbenstein B，Lopez C，Minson Ad and studdertMJ.The family Herpesviridae；an update.Arch Virol.1992，123425-449)。该病毒在自然条件下能感染猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊、狐等动物。除猪以外，其他动物感染伪狂犬病毒后，具有发热、奇痒和急性脑脊髓炎等典型症状，均为致死性感染。该病在猪呈爆发流行。猪是该病毒的储藏者和传染源，主要表现为母猪的繁殖障碍和仔猪大量死亡，其中15日龄以内仔猪死亡率高达100％。伪狂犬病给养猪业造成巨大的经济损失。在伪狂犬病疫苗研究和应用方面，目前主要包括弱毒疫苗和灭活疫苗两种。弱毒疫苗由于该病毒的潜伏感染特性，因此存在着不安全和散毒问题。一般认为，灭活疫苗的安全性要高于弱毒疫苗，但其效力要差一些。随着基因工程技术的发展，人们研制出了一些针对伪狂犬病防制的基因缺失疫苗，即利用基因工程方法插入或删除PrV基因组的一段序列，使某些基因不表达，达到致弱PrV而又不影响其免疫原性的目的。此外，基因缺失疫苗还可以降低免疫猪攻毒后的排毒能力，其自身的潜伏感染能力也大大下降。这些人工改造的基因缺失疫苗不仅在安全方面更为可靠，而且还有利于建立鉴别诊断方法。二者相结合，不但可预防伪狂犬病，而且能够区分出自然感染猪群与免疫猪群，通过逐渐淘汰自然感染猪，建立健康猪群，以致最终达到根除伪狂犬病的目的。猪伪狂犬病根除的难点在于伪狂犬病毒的长期潜伏性以及病毒的免疫逃避而造成的免疫失败。研究表明，伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制伪狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。在伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗的研制方面，华中农业大学于2003年研制出一种伪狂犬病毒TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗，该疫苗具有较好的免疫效果，所述的伪狂犬病毒株缺失了TK-/gE-/gI-基因，不含外源基因，属于一种用基因工程构建的活疫苗(参见中国专利技术专利公开说明书，专利申请号03156706.1)；四川农业大学报道了一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-/LacZ+基因缺失标志致弱活疫苗，该毒株缺失TK-/gE-/gI-基因，但包含外源基因LacZ的表达盒(参见，郭万柱等，伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)某些生物学特性研究，中国预防兽医学报，2000年9期)；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建完成了gE/TK基因缺失突变株，该突变株含有外源基因LacZ的表达盒(参见田志军等，伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建，中国预防兽医学报，2004年5期)；南京农业大学报道了一种伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE-/gI-/GFP+缺失株(参见姜焱等，伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE-/gI-/GFP+缺失株的构建)微生物学报，2003(2)15-20)，该缺失株含有外源基因绿荧光蛋白GFP的表达盒。通常来说，把外源基因引入突变株，对于该突变株的筛选来说无疑是一条捷径，因为这样可以大大提高筛选的效率。有专家强调指出，LacZ，LUC等报告基因属外来基因，在生物体内有可能影响其生物学特性，而对生物体产生一些负面的影响；再者，用于生物体的生物制剂是不允许随便带人外来基因的，因而这些插入报告基因的基因缺失疫苗一般只能用来作为研究伪狂犬病的潜伏感染及其体内增殖的动力学的一种手段，不能作为商品进入市场(金升藻等，伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展，中国农业科学，2002，35(1)89-93)。因此上述三种基因缺失疫苗由于存在上面所提到的缺陷，一旦进入市场可能存在生物安全问题。本申请人曾经研制一种缺失了TK/gE/gI基因的伪狂犬病基因疫苗(参见中国专利技术专利申请公开说明书，专利申请号03156706.1)具有较好的免疫效果且不含外源基因，是对现有疫苗的一大贡献，但作为致弱的活疫苗依然可能存在着返强的危险。因此研制一种免疫效果好，又安全的伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗是当前生产上急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的任务在于克服现有技术存在的缺陷，通过基因重组方法获得一株重组的伪狂犬病基因工程毒株，利用该毒株制备一种防制效果好和安全性高的伪狂犬病gE、gI基因缺失标志灭活疫苗。基于上述专利技术的思想，本专利技术还包括一种缺失gE、gI基因的伪狂犬病毒基因工程毒株、含有该毒株制备的灭活疫苗及其应用。本专利技术通过以下技术方案实现本专利技术实施的关键，是本申请人通过基因重组技术得到一株重组的伪狂犬病毒Pseudorabies virus毒株，该毒株的编号为WKQ-001，该毒株已于2005年9月2日，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC-V200511。本专利技术重组的伪狂犬病毒毒株，该毒株具有以下显著特征1)该重组毒株缺失了gE、gI基因；2)该重组毒株不含外源基因。本申请人利用该保藏的伪狂犬病毒Pseudorabies virus毒株WKQ-001，CCTCC-V200511制备一种伪狂犬病毒缺失疫苗。所述的基因缺失疫苗是灭活疫苗，它是按照以下配比制备的按份数计A、水相3份每一份水相按96份用权利要求1或2所述的伪狂犬病毒株制备的灭活的伪狂犬病毒液加4份灭菌吐温80配制；B、油相6份每一份油相按以毫升计的94份10号兽用白油，加入以克计的2份硬脂酸铝和以毫升计的6份司本-80比例配制，和C、混合上述A和B所述的水相和油相，即得到所述的灭活疫苗。更详细的技术方案如以下所示用于本专利技术基因重组的来源毒株是伪狂犬病毒毒株Ea株(参见陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998，29(2)，972104)作为亲本株，将PrV的糖蛋白基因gI、gE编码区部分缺失，从而得到缺失突变株，该突变株保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC-V200511。制备伪狂犬病毒基因缺失标志灭活疫苗的具体步骤是1)重组狂犬病毒的毒株的制备用中间转移质粒pIESE(该质粒已于2005年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NOM205101)，与伪狂犬病毒Ea株(简称PrV Ea，下同)基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2，出现病变后，收毒。经过PCR筛选和空斑筛选获得到PrV gE-/gI-突变株，该毒株的编号为WKQ-001，属于一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组的伪狂犬病毒Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ毒株ＷＫＱ－００１，保藏在ＣＣＴＣＣ，保藏编号为ＣＣＴＣＣ－Ｖ２００５１１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，张松林，宋云峰，方六荣，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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