调节VEGF转录产物稳定性的治疗性分子制造技术

本发明专利技术公开了用于治疗动物，特别是哺乳动物，例如人局部缺血疾病的核酸组合物和方法。具体地说，本发明专利技术公开了含有或编码调节血管内皮生长因子基因转录物稳定性的序列的核酸分子，以及用于调节血管生成或血管形成，特别是用于治疗局部缺血疾病方法中含有这种分子的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及局部缺血疾病或病症，包括心脏、肾脏和脑缺血以及影响四肢和手足的局部缺血疾病领域。更具体地说，本专利技术涉及用于治疗动物，特别是哺乳动物，例如人的局部缺血疾病的核酸组合物和方法。具体地说，本专利技术涉及含有或能编码调节血管内皮生长因子基因转录物稳定性的序列的核酸分子，以及用于调节血管生成或血管形成，特别是用于治疗局部缺血疾病方法中的含有这种分子的药物组合物。本说明书引用的大量出版物和文献的细节见本说明书末尾处。
技术介绍
血管发育是所有组织生长所必需的，缺乏足够的组织血管形成将导致细胞缺乏氧气和营养。这会刺激细胞产生血管生成因子，该因子的功能是募集新血管长入缺乏(氧气和营养)的组织。涉及新血管形成的最重要血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，该因子可受到高度调节，包括单个基因交替剪接所产生的四种同种型(1，2)。所有这四种同种型的特征在于长度异常和富含GC的5’-和3’-UTR(1，2)，该UTR含有参与VEGF表达调节的大多数重要的控制和调节元件(见3，4的综述)。这些元件包括几个内部核糖体进入位点(IRES)(5，6)、缺氧效应元件(HRE)(7)和一些稳定和去稳定序列(8，9)。VEGF所介导的血管形成在疾病状态中的重要性使它成为有吸引力的基因治疗靶位。目前已研究了下调VEGF来治疗肿瘤和眼新血管形成的几种方法(10-12)。此外，本专利技术人以前描述了能靶向VEGF基因5’-UTR的有义寡核苷酸(DS-085)，并已证实可在体外和体内有效下调VEGF的转录以及随后的翻译(13)。推测其作用机制是通过双螺旋DNA大沟内的Hoogsteen氢键合此外捕获了聚合酶(14-18)，该寡核苷酸类似于其它基因的调节区域也富含GA嘌呤残基(19，20)。专利技术概述本专利技术依据以下发现即VEGF基因非翻译区的其它控制元件有助于降低基因表达。如下所述，本专利技术人发现含有一种或多种这些控制元件的寡核苷酸或表达这些元件的多核苷酸在体外和体内提高了VEGF的表达，增加了体内血管生成，可用于治疗或预防局部缺血疾病。因此，一方面，本专利技术提供基本上由如下式所示的至少一种核苷酸序列组成的分离的核酸分子AnWGGGGBm(I)，其中W是A、T或U；An是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列An含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和Bm是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列Bm含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。各An和Bm宜含有选自A、T、U、G和C的相同或不同核苷酸或它们的衍生物或类似物。所述核酸分子优先能提高表达VEGF的宿主细胞表达VEGF。在该类型的一示范性实施方案中，所述核酸分子能提高VEGF基因转录物在表达该转录物的宿主细胞中的稳定性。在一些实施方案中，所述核酸分子含有式(I)所示核苷酸序列的一个或多个串联重复。在该类型的一示范性例子中，所述核酸分子如下式所示p(II)其中An、Bm和W如式(I)所定义；和p是2到约20的整数。在一些实施方案中，该核苷酸序列选自AGGGG、TGGGG或UGGGG。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子基本上由一条或多条选自GGAGGAGGGGGAGGAG或AGGAAGAGGAGAGGGG的序列构成。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子基本上由对应于VEGF转录物的非翻译区或其一部分的核酸序列构成，所述序列长度至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或35到约100、150、200、300、400或500个核苷酸。这种核酸序列的示范性例子见SEQ ID NO6和7。本专利技术也考虑了含有与那些序列之一的一部分具有约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或甚至约90％相同的序列区域的核酸分子，只要得到的简并核苷酸序列保留了足够的同源性而使与之操作性相连的转录物去稳定从而能提高表达VEGF的宿主细胞中VEGF的量。在一些实施方案中，所述核酸分子是含有至少一条式(I)所示序列的寡核苷酸。该寡核苷酸宜含有至少5、6、7、8、9或10到约15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。这种寡核苷酸的示范性例子见SEQID NO9-36。期望该寡核苷酸耐受核酶。在其它实施方案中，所述核酸分子是含有编码基本上由至少一条式(I)所示核苷酸序列构成的转录物的核苷酸序列的多核苷酸。在还有其它实施方案中，所述核酸分子是含有这种与启动子操作性相连的多核苷酸的构建物。可将本专利技术所述的核酸分子制备成各种组合物，也可用合适的药物载体配制后给予人或动物对象以增加VEGF表达。因此，在另一方面，本专利技术提供含有一种或多种以上广为描述的核酸分子与任选的药学上可接受的佐剂、运载体或稀释剂的药物组合物。在还有另一方面，本专利技术提供增加VEGF表达的方法，该方法包括将含有至少一种以上式(I)所示核苷酸序列的核酸分子引入表达VEGF的宿主细胞。本专利技术所述的核酸分子与含有这些分子的组合物可提高血管生成，因此提供了新的有用治疗或预防方法来治疗、预防、控制或缓解各种可从提高血管生成或血管形成获益的疾病症状。这些疾病宜为局部缺血疾病，其示范性例子包括脑缺血、肠道缺血、脊髓缺血、心血管缺血、心肌梗塞相关的心肌缺血、充血性心力衰竭(CHF)相关的心肌缺血、年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的缺血、肝缺血、肾缺血、真皮缺血、血管收缩诱导的组织缺血、阴茎异常勃起导致的阴茎缺血、血栓栓塞疾病相关的缺血、微血管疾病相关的缺血、和糖尿病、坏疽病、创伤后综合征、心脏停跳复苏(cardiac arrest resuscitation)、外周神经损伤或神经疾病相关的缺血。因此，在另还有一方面，本专利技术提供增加组织中血管生成或血管形成的方法。这些方法通常包括使可表达VEGF的组织与含有如上定义的式(I)所示至少一种核苷酸序列的核酸分子接触或与含有其量足以提高组织中VEGF的表达或含量的这种核酸分子的药物组合物相接触。在一些实施方案中，所述组织选自脑组织、肠组织、脊髓组织、心肌组织、眼组织、肝组织、肾组织、皮肤组织、阴茎组织、含有伤口或移植组织的组织。在一相关方面，本专利技术提供增加某对象中血管生成或血管形成的方法。这些方法一般包括给予该对象含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子或含有这种核酸分子的药物组合物来增加血管生成或血管形成。在另一相关方面，本专利技术提供预防或治疗局部缺血疾病或缓解、预防或治疗患有或处于发生这类疾病或损伤危险之中的对象的局部缺血相关组织损伤的方法，该方法包括给予对象有效量的含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子或含有这类核酸分子的药物组合物来治疗局部缺血疾病或减轻组织损伤。在还有另一相关方面，本专利技术提供含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子在制备增加血管生成或血管形成，或预防或治疗局部缺血疾病，或缓解、预防或治疗局部缺血相关组织损伤的药物中的应用。提出的本文所定义的控制元件是RNA-去稳定元件，故可通过降低VEGF转录物的稳定性来减少该转录物的表达。因此，本专利技术人认为本文所定义的控制元件也可用于使异源转录物去稳定，这是(例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基本上由下式所示的至少一种核苷酸序列组成的分离的核酸分子：　　　　Ａ↓［ｎ］ＷＧＧＧＧＢ↓［ｍ］　　（Ⅰ），　　　　其中Ｗ是Ａ、Ｔ或Ｕ；　　　　Ａ↓［ｎ］是ｎ个核苷酸构成的序列，其中ｎ是０到约１１个核苷酸，序列Ａ↓［ｎ］含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和　　　　Ｂ↓［ｍ］是ｍ个核苷酸构成的序列，其中ｍ是０到约１１个核苷酸，序列Ｂ↓［ｍ］含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：EP拉克辛，RJ马拉诺，
申请(专利权)人：莱恩斯眼科协会有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]