表达新型肿瘤抑制基因ｐ５３的重组腺病毒制造技术

本发明专利技术为一种表达新型肿瘤抑制基因ｐ５３的重组腺病毒的表达结构，其主要特征为１）野生型Ｐ５３抑癌基因的第７２位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；２）该Ｐ５３抑癌基因在其Ｎ－末端以内切酶Ｎｈｅｌ和Ｃ－末端以内切酶ＢａｍＨ１片段拼接于穿梭质粒ｐＤＣ３１５超强启动子ｍＭＣＶ的下游；和３）重组的腺病毒载体为以Ａｄ３５纤突结取代Ａｄ５型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体。该新型ｐ５３抑癌基因腺病毒具有感染力更强、感染组织／细胞谱更广、表达新型ｐ５３抑癌基因更强、其产物具有更强细胞凋亡生物功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒备制方法，其备制的重组腺病毒表达一种具有较野生型P53的细胞凋亡功能更强的新型肿瘤抑制基因p53蛋白，用于多种癌症的治疗。因此其所在的
与生命医药和生物技术有关。
技术介绍
P53基因是肿瘤抑制基因家族中的主要成员，是目前发现与人类肿瘤发生的相关性最高的基因。野生型p53基因在维持细胞正常生长、抑制恶性肿瘤细胞增生中起重要作用。环境中各种的因素，如紫外线、放射线和化学物质以及机体自身产生的某些代谢产物等都可导致细胞DNA损伤。在正常生理情况下，这些细胞DNA能在某些基因产物作用下进行修复或被降解清除，防止其遗传下去而保持正常DNA的复制，进而保护细胞的正常功能运作。否则损伤的DNA会继续复制、随染色体分离，导致染色体组中出现大量的DNA突变和染色体畸变。这些突变的进一步积聚将便正常细胞最终恶化，发展成癌细胞。现有的大量研究表明野生型P53蛋白质在细胞内发挥着“基因卫士”的生物功能作用，监视着细胞基因组的完整性和稳定性。在细胞DNA受到损伤时，P53迅速活化P21基因的转录，抑制多种原癌基因，如c-Fos、c-jun、Rb和其他相关基因如IL-6、PCNA的转录，使细胞分裂停滞在G1期节点。同时，野生型P53蛋白质与复制因子(RPA)相互作用，参与DNA的复制和修复。更为重要的是，野生型P53蛋白质能启动细胞程序性死亡过程，诱导细胞自杀，防止具有恶变倾向的细胞进一步分裂、增殖，从而防止癌症的发生。P53基因突变是人类恶性肿瘤中最常见的遗传变异。据统计，大约有50％的人类肿瘤发生与P53基因突变有关，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的结肠癌存在P53基因突变；几乎100％的小细胞性肺癌有P53基因突变。此外，动物实验表明，表达异常P53基因蛋白的小鼠100％的发生肿瘤。由于P53基因如此重要的生物学功能及其与人类肿瘤发生和恶性程度有密切关系，在八十年代以来，科学家就开始了应用外源野生型P53基因的生物学功能，启动P53基因缺陷型肿瘤细胞的细胞程序性凋亡过程，诱导肿瘤细胞自杀死亡的实验研究和临床肿瘤基因治疗研究。现在众多的研究报告以及临床研究结果证明，野生型P53基因冶疗安全、有效，而且毒副作用小。临床研究结果表明，野生型P53基因对人头颈肿瘤、脑胶质细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有较好疗效。同时研究还表明野生型P53基因还具有抑制肿瘤组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的作用，因而减少肿瘤组织内血管的形成，减少肿瘤组织的血供，起着进一步促进肿瘤细胞死亡的作用。野生型P53基因的某些氨基位点在自然状态下存在多态性，例如在47位点存在脯氨酸/丝氨酸多态性。研究发现野生型P53此47位点为脯氨酸，但在不足5％的非州藉美国人为丝氨酸。已知47位点脯氨酸介导的激酶p38MAPK使邻近的46位点丝氨酸磷酸化可大大增加诱导细胞凋亡的能力；而47位点为丝氨酸的变异，则使p53诱导细胞凋亡的能力下降2-5倍以上。同样，野生型P53基因的72位点存在常见的脯氨酸(P72，下同)/精氨酸(R72，下同)多态性，这种多态性对于野生型P53基因的细胞调亡诱导功能上有很大的意义。P53基因为R72型的，其细胞调亡能力比P72型的强2-15倍以上(Murphy M，et al2003，3(3)357-65，Nat.genetics)，其机理被认为至少部份是由于R72型p53基因增加了在线粒体的聚集，能直接与促细胞调亡蛋白BAK相互作用，破坏线粒体，使细胞缺乏能量而导致细胞调亡有关。通过对P53基因第72号密码子多态变异体功能性研究导致了检测这种多态性对人类癌症危险性和发展影响的许多研究。有些研究表明p53基因为P72型的，因其细胞调亡能力较弱，与增加的患癌危险性相关；另一报告表明在易于患结肠癌的家族中，p53基因为P72纯合子的个体比为R72纯合子的个体，其患癌的发病年龄较早，且倾向于多发肿瘤。上述研究结果为使用第72位点为精氨酸的野生型p53对肿瘤进行更有效地基因治疗奠定了基础。毫无疑问，抗癌基因治疗的成败取决于整个表达结构三大元件的最佳组合。第一个元件为进入机体细胞内的腺病毒载体，要求安全、高效；第二个元件为治疗基因的有效性；第三个元件为驱动抗癌基因表达的启动子的强弱和组织/细胞特异性。目前，将野生型P53基因导入体内的载体多为复制缺陷型腺病毒载体。这种载体具有感染能力强、靶细胞可以是处于分裂期或是非分裂期、转染细胞后腺病毒载体基因不整合进入人类基因组、可大量生产高滴度腺病毒及其瞬时表达等特点，故复制缺陷型腺病毒载体是目前在肿瘤基因治疗中的首选载体。在肿瘤基因治疗中有着广阔的应用前景。但同时由于这种病毒载体自身的原因，如因其感染细胞须与细胞上的受体结合才能起作用，故其感染与细胞膜上的受体数量呈正比。因此对某些组织细胞而言，由于受体数量少，尤其是肿瘤细胞表面的CAR受体偏少，Ad5对它们的感染有限，故这种病毒难以感染并进入细胞内，有效发挥其携带基因的治疗作用。为了克服这种载体的陷缺，近年研究人员通过基因突变技术，使5型腺病毒的纤突结突变或利用Ad35的纤突结(fiber knob)替代5型腺病毒的纤突结，使感染细胞的范围更广、感染效率更高，对各种造血细胞和肿瘤细胞的感染效率高于普通Ad5，外源基因表达量更多，包装系统高效且稳定。而且，使用的腺病毒数量呈至少一个数量级减少。因此，这应是新一代复制缺陷型腺病毒载体。重组腺病毒驱动治疗基因表达的启动子可以有多种来源的启动子。目前使用较多是mCMV启动子，这是一种超强启动子，属一种突变型CMV启动子，比hCMV启动子的活性强若干倍，但没有组组织/细胞的特导性，对某些毒性作用较大的治疗基因不大适合。因此，研究人员发展了一些组织/细胞特殊性启动子，如与原发性肝癌有关的胎儿甲种球蛋白基因的启动子。此启动子仅在表达胎儿甲种球蛋白的原发性肝癌细胞内驱动治疗基因的表达，属于一种靶向性基因治疗。不过目前证明这种启动了活性较低，有待进一步研究。但无论如何，靶向性基因治疗是目前和将来癌症治疗研究的一个非常重要的发展方向。综上所述，构建以新一代复制缺陷型腺病毒为表达载体，利用超强CMV启动子驱动表达R72型的肿瘤抑制基因P53的表达系统，为临床治疗恶性肿瘤提供一种新的、抗癌作用更强的肿瘤基因治疗的药物，将拥有巨大市场前景的，产生诱人的社会、经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的以细胞调亡功能更强的R72型肿瘤抑制基因P53为治疗基因，以新一代复制缺陷型腺病毒载体和超强启动子mMCV为调控元件，构建新一代抗癌作用更强的肿瘤基因P53表达系统，使其成为临床恶性肿瘤的基因治疗的新一代产品。本专利技术的表达新型抑癌基因P53腺病毒表达结构，其主要特点为1)，野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2).该P53抑癌基因在其N-末端以内切酶Nhe1和C-末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315超强启动子mMCV的下游；3).重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体；4).该新型p53抑癌基因腺病毒表达系统具有感染力强、感染组织/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达新型肿瘤抑制基因ｐ５３的重组腺病毒的表达结构，其主要特征为：ａ）．人野生型Ｐ５３抑癌基因的第７２位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；ｂ）．该Ｐ５３抑癌基因在其Ｎ－末端以内切酶Ｎｈｅ１和Ｃ－末端以内切酶ＢａｍＨ１片段拼接于穿梭质粒ｐＤＣ３１５超强启动子ｍＭＣＶ的下游；ｃ）．重组的腺病毒载体为以Ａｄ３５纤突结取代Ａｄ５型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体；ｄ）．该新型ｐ５３抑癌基因腺病毒表达系统具有感染力更强、感染组织／细胞谱更广、新型ｐ５３抑癌基因表达更强、具有更强细胞凋亡生物功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尚武，朱雅南，
申请(专利权)人：王尚武，朱雅南，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]