用于构建链特异性cDNA文库的组合物和方法技术

在本文中提供了用于制备链特异性cDNA文库的组合物、试剂盒和方法。所述组合物、试剂盒和方法利用双链多核苷酸如RNA‑cDNA双链体的性质以捕获和结合新型测序接头。所述方法是借助大规模并行序列如全长RNA测序(RNA‑Seq)和3’标签数字基因表达(DGE)的可用的转录组分析。

Composition and method for the construction of chain specific cDNA Library

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于构建链特异性cDNA文库的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年4月29日提交的美国临时申请号62/154,584的优先权，公开内容通过整体引用结合于此以用于所有目的。关于在联邦资助的研究和开发下做出的专利技术的权利的声明本专利技术利用在国家科学基金授予的批准号DBI1238243下的政府支持做出。政府在本专利技术中具有某些权利。专利技术背景近期在高通量、下一代测序(NGS)技术方面的进步已经实现了全基因组测序和功能基因组学的新方法，包括任何转录组的综合表征和定量。RNA测序(RNA-Seq)包括由信使和结构RNA产生的互补DNA(cDNA)的直接测序和将测序读序(read)定位(mapping)至参考基因组或基因集以用于基因表达分析。这种技术可以用于鉴别新型转录物、小RNA、可变剪接产物、融合转录物、有义转录物和反义转录物。被称为数字基因表达(DigitalGeneExpression，DGE)的另一种技术使用NGS确定在样品中检测cDNA序列的次数，其与对应于该序列的RNA的相对表达直接相关。进行标准RNA-Seq的一个缺点是在缺乏在转录方向上的信息。链信息确定靶标RNA转录本来源于两个DNA链中的哪一个。该信息可以提供例如在转录本注释、转录本发现和表达分析方面的增加的可信度。维持链取向还允许鉴别反义RNA表达，这是基因调节的重要介质。确定有义和反义表达的水平的能力提供了细胞转录组的更多信息。最近已经开发了用于产生链特异性RNA-Seq文库的方法。例如，一种方法标记原始RNA(例如，通过亚硫酸氢盐处理)或转录的cDNA(例如，通过修饰的核苷酸的结合)中的一条链，随后进行未标记的链的降解。遗憾的是，这些方法是劳动密集的。对于用于产生用于使用下一代测序进行RNA-Seq和数字基因表达(DGE)分析的定向(链特异性)cDNA文库的改进方法，仍然存在需求。专利技术概述在一个方面中，在本文中提供了由RNA样品中的RNA分子产生链特异性cDNA分子的方法。所述方法包括(a)从生物样品中分离所述RNA样品；(b)使所述RNA分子断裂；(b)通过逆转录产生包含所述RNA分子和第一cDNA链的RNA-互补DNA(cDNA)双链体；(c)将部分双链的寡核苷酸5’接头与所述第一cDNA链的3’端退火，其中所述5’接头包含：(i)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含与所述第一cDNA链的所述3’端退火的约6-12个连续随机脱氧核糖核苷酸；和(ii)第二链阻断寡核苷酸，所述第二链阻断寡核苷酸包含与所述第一链捕获寡核苷酸的至少一部分互补的至少20个脱氧核糖核苷酸；和(d)产生所述链特异性cDNA分子。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(a)之后使所述RNA分子断裂。在一些实例中，产生所述链特异性cDNA分子的步骤(d)包括使用DNA聚合酶或其片段延伸所述5’接头的所述第一链捕获寡核苷酸以产生与所述第一cDNA链互补的第二cDNA链。在一些实施方案中，所述方法还包括使用与所述第二链阻断寡核苷酸互补的引物扩增所述第二cDNA链。扩增的步骤包括聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述方法另外包括确定所述被扩增的第二cDNA链的序列。在一些情况中，约8-12个连续脱氧核糖核苷酸与事先选择的第一cDNA链基本上互补。在其他情况中，8-12个连续脱氧核糖核苷酸与事先选择的第一cDNA链100％互补。在一些实施方案中，使所述RNA样品断裂的步骤在含Mg2+的缓冲液中进行。步骤(c)和/或(d)可以在室温下进行。在一些实例中，所述DNA聚合酶或其片段是DNA聚合酶I。在其他实例中，所述DNA聚合酶或其片段是Klenow片段。在一些实施方案中，所述5’接头的所述第二链阻断寡核苷酸是5’磷酸化的。在这样的情况中，所述DNA聚合酶可以是Klenow片段和连接酶。所述生物样品可以是动物组织样品。备选地，所述生物样品是植物组织样品。在另一个方面中，在本文中提供了试剂盒，所述试剂盒包含所述第一cDNA链的3’端的部分双链的寡核苷酸5’接头，其中所述5’接头包含：(i)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含与所述第一cDNA链的所述3’端退火的约6-12个连续随机脱氧核糖核苷酸；和(ii)第二链阻断寡核苷酸，所述第二链阻断寡核苷酸包含与所述第一链捕获寡核苷酸的至少一部分互补的至少20个脱氧核糖核苷酸；与所述第二链阻断寡核苷酸互补的测序引物。任选地，所述试剂盒可以含有说明手册。所述第一链捕获寡核苷酸可以包含在SEQIDNO：1中给出的序列。所述第二链阻断寡核苷酸可以包含在SEQIDNO：2中给出的序列。在一些实施方案中，所述第二链阻断寡核苷酸是5’磷酸化的。所述5’接头的所述3’突出端可以包含约8-12个连续随机脱氧核糖核苷酸。在一些实例中，所述约8-12个连续脱氧核糖核苷酸与所述RNA-cDNA双链体的事先选择的第一cDNA链基本上互补。在其他实例中，所述约8-12个连续脱氧核糖核苷酸与所述RNA-cDNA双链体的事先选择的第一cDNA链100％互补。在又一个方面中，在本文中提供了多核苷酸复合物。所述多核苷酸复合物包含RNA-cDNA双链体，所述RNA-cDNA双链体包含来源于生物样品的RNA分子和通过所述RNA分子的逆转录产生的第一cDNA链，和所述第一cDNA链的3’端的部分双链的寡核苷酸5’接头，其中所述5’接头包含：(i)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含与所述第一cDNA链的所述3’端退火的约6-12个连续随机脱氧核糖核苷酸；和(ii)第二链阻断寡核苷酸，所述第二链阻断寡核苷酸包含与所述第一链捕获寡核苷酸的至少一部分互补的至少20个脱氧核糖核苷酸，其中所述5’接头与所述RNA-cDNA双链体的所述第一cDNA链的3’端退火。可以使用包含随机核苷酸序列的3’接头产生所述第一cDNA链。备选地，可以使用包含polyT序列的3’接头产生所述第一cDNA链。在一些实施方案中，所述5’接头的所述3’突出端包含约8-12个连续随机脱氧核糖核苷酸。所述约8-12个连续脱氧核糖核苷酸可以与所述RNA-cDNA双链体的事先选择的第一cDNA链基本上互补。在其他情况中，所述约8-12个连续脱氧核糖核苷酸可以与所述RNA-cDNA双链体的事先选择的第一cDNA链100％互补。所述第一链捕获寡核苷酸可以包含在SEQIDNO：1中给出的序列。所述第二链阻断寡核苷酸可以包含在SEQIDNO：2中给出的序列。根据以下详细描述和附图，对于本领域技术人员来说，本专利技术的其他目的、特点、和优势将会是显而易见的。附图简述图1示出了链特异性文库合成机制的示意图。将mRNA(101)通过热和镁断裂(1)并且通过含接头的寡核苷酸引发以用于cDNA合成(2和3)。示例性mRNA转录本包括polyA尾(SEQIDNO：18；5’-AAAAAAAAAAAAAAA)。示例性的DGE引物含有SEQIDNO：19(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTV)的核酸序列。示例性SHO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由RNA样品中的RNA分子产生链特异性cDNA分子的方法，所述方法包括：(a)从生物样品中分离所述RNA样品；(b)通过逆转录产生包含所述RNA分子和第一cDNA链的RNA‑互补DNA(cDNA)双链体；(c)将部分双链的寡核苷酸5’接头与所述第一cDNA链的3’端退火，其中所述5’接头包含：(i)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含与所述第一cDNA链的所述3’端退火的约6‑12个连续随机脱氧核糖核苷酸；和(ii)第二链阻断寡核苷酸，所述第二链阻断寡核苷酸包含与所述第一链捕获寡核苷酸的至少一部分互补的至少20个脱氧核糖核苷酸；和(d)产生所述链特异性cDNA分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.29 US 62/154,5841.一种由RNA样品中的RNA分子产生链特异性cDNA分子的方法，所述方法包括：(a)从生物样品中分离所述RNA样品；(b)通过逆转录产生包含所述RNA分子和第一cDNA链的RNA-互补DNA(cDNA)双链体；(c)将部分双链的寡核苷酸5’接头与所述第一cDNA链的3’端退火，其中所述5’接头包含：(i)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含与所述第一cDNA链的所述3’端退火的约6-12个连续随机脱氧核糖核苷酸；和(ii)第二链阻断寡核苷酸，所述第二链阻断寡核苷酸包含与所述第一链捕获寡核苷酸的至少一部分互补的至少20个脱氧核糖核苷酸；和(d)产生所述链特异性cDNA分子。2.权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之后使所述RNA分子断裂。3.权利要求1所述的方法，其中产生所述链特异性cDNA分子包括使用DNA聚合酶或其片段延伸所述5’接头的所述第一链捕获寡核苷酸以产生与所述第一cDNA链互补的第二cDNA链。4.权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用与所述第二链阻断寡核苷酸互补的引物扩增所述第二cDNA链。5.权利要求4所述的方法，其中扩增包括聚合酶链反应。6.权利要求1所述的方法，所述方法还包括确定所述被扩增的第二cDNA链的序列。7.权利要求1所述的方法，其中所述3’突出端包含与事先选择的第一cDNA链基本上互补的约8-12个连续脱氧核糖核苷酸。8.权利要求1所述的方法，其中所述3’突出端包含与事先选择的第一cDNA链100％互补的约8-12个连续脱氧核糖核苷酸。9.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是动物组织样品。10.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是植物组织样品。11.权利要求1所述的方法，其中使所述RNA样品断裂在含Mg2+的缓冲液中进行。12.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)和/或(d)在室温下进行。13.权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶或其片段是DNA聚合酶I。14.权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶或其片段是Klenow片段。15.权利要求1所述的方法，其中所述5’接头的所述第二链阻断寡核苷酸是5’磷酸化的。16.权利要求15所述的方法，其中所述DNA聚合酶是Klenow片段和连接酶。17.一种试剂盒，所述试剂盒包含部分双链的寡核苷酸5’接头，所述部分双链的寡核苷酸5’接头包含：(a)第一链捕获寡核苷酸，所述第一链捕获寡核苷酸包含至少20个脱氧核糖核苷酸，和3’突出端，所述3’突出端包含约6-12个连续随机脱氧核...

【专利技术属性】
技术研发人员：布拉德·汤斯利，迈克尔·F·科温顿，尼利马·辛哈，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US