通过MHC细胞文库检测新免疫原性T细胞表位和分离新抗原‑特异性T细胞受体的方法技术

本发明专利技术涉及免疫疗法的领域，特别是过继性T细胞疗法、T细胞受体(TCR)基因疗法和接种疫苗。本发明专利技术提供一种制备编码TCR构建体的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自主要组织相容性复合物(MHC)上呈递的抗原的表位是特异性的，该方法包括使从供体分离的T细胞与人工抗原呈递细胞(APC)的文库接触，所述人工抗原呈递细胞包括表达存在于供体，优选地在K562细胞中的所有MHC I或MHC II等位基因的细胞。TCR构建体可在T细胞中表达，其对例如癌、病毒性感染或自身免疫性疾病的过继性T细胞疗法是有用的。本发明专利技术还提供一种鉴定由所述TCR识别的表位的方法。由所述TCR识别的免疫原性表位可被用来开发在患者中诱导抗原‑特异性T细胞免疫的疫苗制剂。本发明专利技术还提供两个TCR构建体和通过本发明专利技术的方法获得的各自的免疫原性表位的对，其中表位来自人乳头瘤病毒(HPV) 16 (也称为α乳头瘤病毒9)癌蛋白E5和人巨细胞病毒(CMV)蛋白pp65。

The new library of MHC cell immune detection of the original T cell method and isolation of T cell receptor specific antigen

The present invention relates to the field of immunotherapy, in particular adoptive T cell therapy, T cell receptor (TCR) gene therapy and vaccination. The invention provides a preparation of TCR encoding TCR construct alpha chain constructs (TRA) constructs and TCR beta chain (TRB) method of nucleic acid, the TCR construct of major histocompatibility complex (MHC) on the presentation of the antigen epitope is specific. The method includes the separation of T from donor cells and artificial antigen-presenting cells (APC) library of contact, the artificial antigen presenting cells including expression in donor, preferably all MHC in K562 cells of I or MHC alleles of II cells. TCR constructs can be expressed in T cells, which are useful for adoptive T cell therapy, such as cancer, viral infection, or autoimmune disease. The invention also provides a method for identifying the epitopes identified by the TCR. By the TCR identification of immunogenic epitopes can be used to develop T cell induced immune specific antigen in patients with in vaccine preparations. The invention also provides two TCR constructs and obtained by the method of the invention of the respective immunogenic epitopes of the epitope, from human papillomavirus (HPV) 16 (also known as alpha papillomavirus 9) cancer protein E5 and human cytomegalovirus (CMV) protein pp65.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过MHC细胞文库检测新免疫原性T细胞表位和分离新抗原-特异性T细胞受体的方法本专利技术涉及免疫疗法的领域，特别是过继性T细胞疗法、T细胞受体(TCR)基因疗法和接种疫苗。本专利技术提供一种制备编码TCR构建体的TCRα链构建体(TRA)和TCRβ链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自主要组织相容性复合物(MHC)上呈递的抗原的表位是特异性的，该方法包括使从供体分离的T细胞与人工抗原呈递细胞(APC)的文库接触，所述人工抗原呈递细胞包括表达存在于供体，优选地在K562细胞中的所有MHCI或MHCII等位基因的细胞。TCR构建体可在T细胞中表达，其对例如癌、病毒性感染或自身免疫性疾病的过继性T细胞疗法是有用的。本专利技术还提供一种鉴定由所述TCR识别的表位的方法。由所述TCR识别的免疫原性表位可被用来开发在患者中诱导抗原-特异性T细胞免疫的疫苗制剂。本专利技术还提供两个TCR构建体和通过本专利技术的方法获得的各自的免疫原性表位的对，其中表位来自人乳头瘤病毒(HPV)16(也称为α乳头瘤病毒9)癌蛋白E5和人巨细胞病毒(CMV)蛋白pp65。T细胞受体(TCR)基因疗法是治疗各种病毒-和癌症-相关适应症的有前景的免疫治疗策略。一个重大的障碍是在临床前和临床环境中缺乏待分析的有效TCR的可用性。目前检测和分离抗原-特异性TCR的方法具有技术局限性，限制于某些MHC或需要抗原表位的先前知识。靶抗原的选择是免疫疗法成功的另一个重要的因素。靶向抗原(其在肿瘤组织中，但不在正常组织中特异性地表达)具有特别的价值。过继性T细胞疗法基于T细胞的离体激活和扩增，以生成供再输注进入患者的抗原-特异性效应T细胞(1)。这个过程可通过用新抗原受体遗传修饰T细胞来实现。快速的离体扩增方案能够生成大量的T细胞，以打破肿瘤微环境的免疫抑制屏障来清除靶细胞。克服免疫抑制屏障可导致溶解的肿瘤细胞被APC吸收和呈递更多的抗原–一个称为表位扩展的过程。这可接着从新启动自身T细胞和再激活无变应性T细胞，放大抗-肿瘤免疫应答，其由过继性T细胞疗法诱导。使用遗传未修饰的以及抗原受体-工程改造的T细胞的过继性T细胞疗法已成功地用来治疗对其它治疗顽固的癌症和病毒-相关疾病(2)。提供给患者T细胞免疫的第二个策略是疫苗的应用。疫苗提供对特定病原体或癌症的获得性免疫力，许多疫苗的市场引入已导致由许多威胁生命的疾病引起的发病率和死亡率的令人印象深刻的下降。为了开发新的预防和治疗疫苗，先决条件是鉴定抗原、表位和MHC限制成分，其诱导T细胞应答，所述T细胞应答可提供免于表达这样的抗原的病原细胞的保护和表达这样的抗原的病原细胞的清除。由病原细胞内部加工和呈递且由抗原-特异性TCR识别的抗原表位的鉴定，使诱导抗原-特异性免疫的新疫苗制剂的开发成为可能。在下文中，对鉴定和分离抗原-特异性TCR和鉴定诱导T细胞应答的抗原表位的当前方法进行评述。外周血单核细胞(PBMC)是用于体外分析的T细胞的主要来源。为了筛选，大量的T细胞可从患者或健康供体血的PBMC容易地分离。相比之下，从肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL)分离的T细胞以有限的量从肿瘤活组织检查中获得。活组织检查可仅从实体瘤获得(3,4)。来自PBMC或TIL的TCR的直接序列分析可生成有关TCR序列的大量数据。从这些数据集预测TCR特异性和抗原识别仍然是不可能的(5)。为从T细胞样品以所需特异性分离TCR，在分析TCR序列之前，引入抗原-特异性富集步骤是必要的。此外，在TCR分离之前，进行功能测定以证实T细胞的抗原特异性是有用的(6)。富集T细胞的标准途径是基于抗原-特异性体外刺激，以扩增培养中的特异性T细胞。体外刺激抗原-特异性T细胞的一个策略是加入肽至T细胞培养物中，其结合于MHCI分子。在培养中的细胞彼此呈递肽，而抗原-特异性CD8+T细胞长出。然而，肽刺激，其通常以非-生理浓度进行，可导致T细胞的过度刺激和激活-诱导的细胞死亡，所述T细胞包含对肽/MHC(pMHC)I的高亲和力TCR(7)。此外，表位序列、加工特性和MHCI结合限制的知识是需要的。此外，PBMC或TIL样品内肽-特异性T细胞的存在是必要的。因此，对具有低前体频率的肽-特异性T细胞的筛选可能受到限制并妨碍新的免疫原性抗原-MHCI组合的鉴定。T细胞对抗原-特异性和MHC限制的功能测试通常用单一T细胞克隆进行。扩增和富集后，单一T细胞克隆可生长至足够的量。在应用T细胞培养时必须考虑的一个因素是长期培养条件对生成T细胞的影响(8)。具有更分化表型(Tem和Teff)的T细胞的生长能力受到限制，并限制体外扩增。长期培养可能导致T细胞克隆的有效TCR的损失，所述T细胞克隆已经遭遇体内pMHCI并在供体中经历扩增和分化。因此长期T细胞培养可引入有利于未分化T细胞以高扩增能力长出的偏差。抗原-特异性T细胞的检测和分选是分离新抗原-特异性TCR的至关重要的步骤。具有对pMHC的不同特异性的TCR的大库导致可溶性MHC多聚体的开发，其作为对已知的pMHC特异性的T细胞染色的试剂(9-11)。多聚体被用于抗原-特异性T细胞的分选。多聚体能够直接染色对所需pMHC有特异性的T细胞(12,13)。然而，需要MHC限制和肽特异性的现有知识以筛选样品中的抗原-特异性T细胞。多聚体的使用可依赖于计算机预测T细胞表位，因此包含分离对未经内源加工和呈递的表位特异性的TCR的风险。此外，根据T细胞结合多聚体的能力，但不必然根据在细胞表面结合pMHC复合物来选择T细胞。多聚体是定制的试剂，其不能容易地获得以筛选不同的pMHC组。在1997年，Lemonnier和Pérarnau小组报告了稳定地表达融合于β-2微球蛋白(b-2m)的人HLA-A*02:01分子的单链构建体(HHD)的转基因小鼠的产生。此外，小鼠被敲除鼠MHCI基因。因此，免疫产生专门限制于HHD的抗原-特异性T细胞(14)。因此，HLA-转基因小鼠提供了抗原-特异性T细胞的一种新的来源(15)。人抗原和表位，其在它们的序列中与鼠配对物不相似，可被用于HLA-转基因小鼠的疫苗接种以在非-耐受库中引发抗原-特异性T细胞应答，因为小鼠T细胞在胸腺中未缺失并识别人抗原为异物。HLA-转基因小鼠提供一种识别自身-抗原或类似于自身-抗原的高亲和力TCR的来源，其由于胸腺选择已在人库中缺失。当基于HHD小鼠模型，产生携带人TCR库的第一转基因小鼠，同时鼠TCR基因座被敲除时，取得技术进步(16)。然而，使用MHC-转基因和/或TCR基因座-转基因小鼠的潜在问题可出现，例如，难以预测小鼠和人胸腺选择是否遵循相同的规则。转基因MHC分子是人工单链构建体，其可引入选择功能限制于单链MHC而非天然MHCI复合物的TCR的偏差。单一MHC-转基因小鼠的免疫不反映具有6个同源MHC:I复合物的选择的天然免疫应答。有可能存在不含有例如HLA-A*02:01表位的抗原。此外，携带人TCR基因座的小鼠缺乏少数TCR链，其对靶向某些pMHCI可能是至关重要的(16)。作为对比，携带鼠TCR基因座的小鼠的免疫将导致鼠TCR序列的分离，当转移至人时，其可倾向于排斥(17,18)。一个重要的经济因素是用鼠模型工作必需的基础设施，其在成本、监管要本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码T细胞受体(TCR)构建体的TCR α链构建体(TRA)和/或TCR β链构建体(TRB)的核酸，所述TCR构建体对与人MHC I复合的表位是特异性的，其中所述表位是人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位，其中所述核酸可优选地获自包括以下的方法(a) 用呈递所述限定抗原的表位并与供体分享至少一个MHC等位基因的专职抗原呈递细胞，刺激从供体分离的T细胞，以富集抗原‑特异性T细胞；和(b) 使所述T细胞接触细胞文库，其中每个细胞表达单一MHC等位基因，其中所述文库包含表达存在于供体中的所有MHC I等位基因的细胞，和其中所述文库的细胞呈递所述限定抗原的表位；和(c) 选择由所述接触激活的T细胞，优选地基于由所述激活的T细胞表达的激活标记进行；和(d) 分离编码所述T细胞的TCR的TCR α和TCR β链的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.16 EP 15159212.81.编码T细胞受体(TCR)构建体的TCRα链构建体(TRA)和/或TCRβ链构建体(TRB)的核酸，所述TCR构建体对与人MHCI复合的表位是特异性的，其中所述表位是人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位，其中所述核酸可优选地获自包括以下的方法(a)用呈递所述限定抗原的表位并与供体分享至少一个MHC等位基因的专职抗原呈递细胞，刺激从供体分离的T细胞，以富集抗原-特异性T细胞；和(b)使所述T细胞接触细胞文库，其中每个细胞表达单一MHC等位基因，其中所述文库包含表达存在于供体中的所有MHCI等位基因的细胞，和其中所述文库的细胞呈递所述限定抗原的表位；和(c)选择由所述接触激活的T细胞，优选地基于由所述激活的T细胞表达的激活标记进行；和(d)分离编码所述T细胞的TCR的TCRα和TCRβ链的核酸。2.权利要求1的核酸，其中表位是限制于HLA-B*15:01的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位，其优选地包含SEQIDNO:1。3.权利要求2的核酸，其中TRA包含与SEQIDNO:2具有至少84%序列同一性的CDR3，其中CDR3优选地含有SEQIDNO:2，其中TRA的可变区优选地具有与SEQIDNO:3至少80%序列同一性，和其中TRA优选地包含SEQIDNO:4并由SEQIDNO:5编码；和/或其中TRB包含与SEQIDNO:6具有84%序列同一性的CDR3，其中CDR3优选地含有SEQIDNO:6，其中TRB的可变区优选地具有与SEQIDNO:7至少80%序列同一性，和其中TRA优选地包含SEQIDNO:8并由SEQIDNO:9编码。4.编码TCR构建体的TRA和/或TRB的核酸，所述TCR构建体对与人MHCI复合的表位是特异性的，其中TCR构建体对与HLA-B*07:02复合的人巨细胞病毒蛋白pp65的表位是特异性的，该表位由SEQIDNO:10组成，其中TRA包含依据SEQIDNO:11的CDR3和/或其中TRB包含依据SEQIDNO:15的CDR3。5.权利要求4的核酸，其中TRA的可变区具有与SEQIDNO:12至少80%序列同一性，和其中TRA优选地包含SEQIDNO:13并由SEQIDNO:14编码；和/或其中TRB的可变区具有与SEQIDNO:16至少80%序列同一性和其中TRB优选地包含SEQIDNO:17并由SEQIDNO:18编码。6.包含任一项前述权利要求的核酸的宿主细胞，所述核酸编码对人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位或对人巨细胞病毒蛋白pp65的表位特异性的TCR构建体的TRA和TRB，并表达所述TCR，其中宿主细胞优选地是CD8+T细胞。7.由权利要求1-5的任一项的核酸编码的蛋白，优选地，包含TRA和TRB。8.权利要求7的蛋白，权利要求6的重组T细胞，或权利要求1-5的任一项的核酸，其中TCR构建体包含TRA和TRB，用于药用组合物，优选地，用于治疗以下感染的...

【专利技术属性】
技术研发人员：F洛伦茨，W乌克特，C埃林格，D申德尔，
申请(专利权)人：马克思德布鲁克分子医学中心亥姆霍兹联合会，德国慕尼黑赫姆霍兹环境和健康研究中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE