消耗乙酸盐/酯的酵母细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏；b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；c)一种或更多种编码同源或异源乙酰‑CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和d)导致对所述酵母而言天然的3‑磷酸甘油磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或3‑磷酸甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。

Yeast cells that consume acetate / ester

The invention relates to a genetically modified yeast cell, comprising: a) of the yeast natural one or more aldehyde dehydrogenase (E.C:1.2.1.4) damage; b) one or more heterologous encoding NAD+ dependent acetylation of aldehyde dehydrogenase (E.C.1.2.1.10) of the nucleotide sequence; c) one or more encoding homologous or heterologous acetyl CoA synthetase (E.C.6.2.1.1) nucleotide sequence; and D) lead to the natural yeast 3 phosphoglycolate hydrolase (E.C.3.1.3.21) and / or 3 glycerophosphate dehydrogenase (E.C.1.1.1.8 or E.C.1.1.5.3) modified to decrease activity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】消耗乙酸盐/酯的酵母细胞专利
本专利技术涉及工程化微生物，例如酵母。具体而言，本专利技术涉及戊糖转化提高的转化乙酸、戊糖和葡萄糖的酵母细胞。本专利技术还涉及其中所述酵母细胞生成发酵产物如乙醇的方法。专利技术背景第二代生物乙醇由例如水解成游离单体糖(如己糖和戊糖)以发酵成乙醇的植物生物质的木质纤维素级分生产。除生物质预处理和水解期间的糖释放外，还形成一些有毒副产物。例如，糠醛和HMF就是这些产物中的两种。它们形成的量取决于几个预处理参数，如温度、压力和预处理时间。木质纤维素水解物也含有大量的乙酸，乙酸是微生物如酵母发酵能力的强抑制物。甘油是糖发酵成乙醇期间的主要副产物，其主要由于再氧化反应消耗在厌氧条件下的乙醇产生期间形成的过量NADH而形成。因此，在工业发酵期间，酵母细胞消耗的约5％至10％的糖被转为甘油。降低这种多元醇的量被认为是增加乙醇产率的有前景的途径。这可以通过调节分批补料过程中的进料速率，或通过选择生成更少甘油的菌株而实现，但这两种方法的效果都相对有限。已经报道几种不同的方法，它们可以帮助减少乙酸对水解物中的糖的发酵能力的抑制作用，以及(例如通过酵母的遗传工程)通过缺失甘油生成中涉及的基因来(部分)解决氧化还原平衡问题。Sonderegger等(2004)公开了在发酵木糖的Saccharomycescerevisiae菌株中磷酸转乙酰酶和乙醛脱氢酶的异源表达。结合天然磷酸酮酶，Sonderegger等由此生成了功能性磷酸酮酶途径，其能够净再氧化NADH，所述NADH由该特定菌株中用于木糖利用的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的异源表达所产生。Guadalupe等(2009)描述了一种Saccharomycescerevisiae菌株，其中通过破坏内源性NAD依赖型3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1和GPD2)而消除副产物甘油的生成。编码乙酰化NAD依赖型乙醛脱氢酶的E.colimhpF基因的表达通过为培养基补充乙酸恢复了gpd1gpd2双缺失菌株厌氧生长的能力。Yu等(2010)构建了经代谢工程化以通过甘油脱氢酶(由GCY1编码)、二羟丙酮激酶(DAK1)和甘油摄取蛋白(GUP1)的同时过表达来提高由甘油生成乙醇的Saccharomycescerevisiae菌株。在同一团队的后来报告中(Yu等，2011)，描述到分别编码醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的ADH1和PDC1的额外过表达引起在发酵条件下的生长速率和甘油消耗增加，导致最终乙醇产率略有增加。Lee和Dasilva(2006)公开了经工程化以通过引入Escherichiacolimgs和gldA基因的表达等由甘油生成1,2-丙二醇的酵母Saccharomycescerevisiae。Guadelupe等(并且还在专利申请WO2011/010923中)描述的技术提供了用于在生物质糖发酵和前述乙酸发酵成例如乙醇期间降低水解物的乙酸含量的方法。通过引入额外的NADH生成途径，例如通过另外(过)表达甘油消耗途径，进一步增强转化乙酸的能力是有潜在可能性的。在表达厌氧乙酸转化途径的酵母菌株(例如Medina等，2009所描述)中引入前述GUP1-、GCY1-和DAK1-基因(Yu等，2010)后，乙酸转化应增加以维持氧化还原平衡，导致水解物的去毒进一步增加且乙醇产率更高。然而Yu等的解决方案不起作用，因为酵母甘油脱氢酶(由GCY1编码)使用NADP+作为辅因子，由于辅因子再生不足而导致辅因子不平衡。替代性甘油脱氢酶(来自于E.coli的gldA)结合乙酸还原途径一起被测试，并且的确提高了在厌氧生长(发酵)条件下乙酸的转化(专利申请WO2013/081456)。尽管如此，仍然需要改善乙酸盐/酯(acetate)、戊糖和/或己糖向发酵产物的转化。专利技术概述因此，本专利技术的一个目标是提供这样的酵母，其能够由乙酸或乙酸盐/酯产生乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力，以及其中这些菌株被用于产生乙醇和/或其他发酵产物的方法。另一个目标是提供细胞，例如酵母细胞，其能够由甘油和/或甘油和乙酸产生乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力。另一个目标是增加发酵产物的产生(产量、生产率或两者)。在一个其实施方式中，酵母产生较少甘油。此外，本专利技术的一个目标是提供能够厌氧地共同发酵乙酸盐/酯、戊糖和葡萄糖的酵母菌株。本专利技术的一个目标是提供通过发酵戊糖和/或乙酸盐/酯产生乙醇的成本有效的方法。本专利技术的另一个目标是提供一种酵母细胞，其能够以比使用本领域目前已知的菌株能够实现的速率更高的速率发酵戊糖。另一个目标是减少C5/C6发酵的发酵时间。通过阅读说明书和权利要求，本专利技术的其它目标、特征和优点很明显。根据本专利技术实现了这些目标中的一个或更多个，本专利技术提供了一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶的破坏；b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；c)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和d)修饰，其导致与不含所述修饰的酵母相比，3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或3-磷酸甘油脱氢酶活性降低。在一个实施方式中，d)中对酵母而言为天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)是对酵母而言为天然的乙醛脱氢酶-6(ALD6)。本专利技术还涉及制备发酵戊糖的酵母细胞的方法，其中使包含戊糖途径的一个或更多个外源基因的酵母细胞经受对所述酵母细胞而言为天然的基因ALD6的破坏。本专利技术还涉及一种发酵方法，其中木质纤维素糖被破坏株(disruptant)酵母细胞转化为发酵产物。在一个其实施方式中，发酵产物是乙醇。本专利技术还涉及有氧增殖乙酸盐/酯消耗酵母的方法。附图简介图1显示了数学模型图式(最小-模型方法)。数字表示以下过程：1.)葡萄糖摄取和代谢(上游-糖酵解)，2.)木糖摄取和代谢，3.)甘油摄取和代谢，4.)乙醇形成(下游糖酵解)，5.)乙酸盐/酯摄取和代谢，6.)生物质形成，7.)用于维持(maintenance)的ATP周转，8.)CO2和乙醇产生。图2显示了所述方法的示意概述图：使用zeoMX标记缺失ALD6。这些修饰被引入YD01247、YD01248中。图3显示了减少维持ATP对葡萄糖和木糖向乙醇的转化率的影响的模型预测。图4显示了涉及乙醛-乙酸盐/酯-乙酰-CoA的无效循环，从而引起维持ATP增加的代谢途径的示意图。虚线箭头表示无效循环。将乙酰化乙醛脱氢酶(adhE，acdH)引入菌株中以使乙酸盐/酯向乙醇转化。图5显示了参照物(YD01248，YD01247；透明线)和ALD6缺失菌株(YD01248ΔALD6，YD01247ΔALD6；实线)之间的糖消耗和乙醇形成率的比较。序列表简介SEQIDNO:1pRN772(携带loxP-kanMX-loxP序列的质粒)SEQIDNO:2引物12388(ald65'侧翼正向)SEQIDNO:3引物12389(ald63'侧翼反向)专利技术详述在本说明书和所附权利要求的通篇，词语“包括”、“包含”和“含有”应被解释为包含性的。换言之，在语境允许的情况下，这些词语意本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏；b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；c)一种或更多种编码同源或异源乙酰‑CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和d)导致对所述酵母而言天然的3‑磷酸甘油磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或3‑磷酸甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.22 EP 15168833.01.一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏；b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；c)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和d)导致对所述酵母而言天然的3-磷酸甘油磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或3-磷酸甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中a)中的对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)是乙醛脱氢酶-6(ALD6)。3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含e)一种或更多种编码异源木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)的核苷酸序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含对所述酵母而言天然的基因gpp1、gpp2、gpd1和gpd2中的一个或更多个的破坏。5.根据权利要求1-4中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·克拉森，约瑟夫·帕图斯·约翰内斯·施米茨，保卢斯·佩特鲁斯·德·瓦尔，阿尔杰·鲍马，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL