鱼类干扰素基因及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种鱼类干扰素基因及其用途。一种分离的基因，其序列为ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示的核苷酸序列，一种分离的蛋白质，其序列为ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所示的氨基酸序列。该基因在病毒感染的细胞中及在稳定转植干扰素基因的细胞株中能显著表达。该基因表达产物在培养细胞和鱼类机体中具有抗病毒感染的用途。可以利用原核表达系统、真核表达系统（如鱼类细胞表达系统和酵母细胞表达系统）等在多个层面上进行鲫鱼干扰素基因的利用和开发，还可作为抗病毒生物制剂，具有渔用抗病毒药物和药用饲料添加剂中的用途，使用方便，抗病毒作用迅速，效果显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，更具体涉及一种鲫鱼干扰素(Interferon，IFN)的核苷酸序列和氨基酸序列，同时涉及到该基因表达产物在培养细胞抗病毒作用中的用途，同时还可作为抗病毒生物制剂、渔用抗病毒药物和药用饲料添加剂中的用途。
技术介绍
在致病微生物导致的疾病中，由病毒引发的疾病，如时常小范围流行的西尼罗脑炎(WNV)和埃博拉出血热(EBV)，在全世界广泛传播的获得性免疫缺陷综合症(HIV)，以及2003年爆发流行的严重急性呼吸道症候群(SARS)，2006年在全世界流行的禽流行性感冒(AIV，如H5N1型)等正严重威胁人类的健康(Kawai and Akira，2006)。渔业养殖同样面临病毒性疾病的严重威胁。如十几年前由草鱼出血病病毒(GCHV)引起的出血病曾使我国的草鱼养殖面临毁灭性打击(死亡率最高达到90％)，流行于欧美的鲤春病毒(SVC)也使该地区的水产养殖损失惨重。干扰素系统是脊椎动物抵抗病毒入侵的第一道防线，能在病毒感染后的几小时内就迅速起启动，在非特异性抗病毒免疫反应中发挥主导作用，同时介导机体随后启动特异性的抗病毒免疫反应(Pulendran and Ahmed，2006)。早先在哺乳类的研究表明，干扰素蛋白本身没有抗病毒作用，其机制在于与宿主细胞的特异受体结合后通过JAK-STAT信号通路诱导一系列的抗病毒蛋白来抑制病毒的复制，最终达到保护细胞抵抗病毒入侵的目的(Stark et al，1998)。一旦宿主细胞受到病毒感染，宿主就能通过模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PPRs)，如TLR3/7/8/9(Toll-like receptor)，RIG-I(retinoic acid inducible gene I)，MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)识别，然后启动细胞内一系列的信号途径诱导一系列基因的表达，其中就包括干扰素(Sen and Sarkar，2005；Kawai andAkira，2006；Arika and Takeuchi，2006)。诱导产生的干扰素再经过自分泌和旁分泌与细胞膜上的干扰素受体结合，激活干扰素诱导的JAK-STAT信号通路，最后启动一系列干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表达，包括抗病毒基因的表达。产生的抗病毒蛋白建立宿主细胞的抗病毒状态，抑制和清除病毒在细胞中的复制(Samuel，2001；Malmgaard et al.，2004；Schultz et al.，2004)。经过近半个世纪的研究，特别是近二十年来的努力，已经鉴定了在干扰素反应发挥抗病毒作用的几个有效途径第一，干扰素诱导和激活细胞Mx(myxovirus-resistant)蛋白，抑制RNA病毒(如流感病毒)衣壳蛋白的转运或病毒RNA的合成(Leong et al.，1998)；第二，诱导活化细胞内蛋白激酶PKR，磷酸化细胞内的eIF2α，从而抑制多肽链的翻译起始，细胞蛋白合成停止，其中包含病毒自身蛋白，病毒的繁殖因此受阻(Sarkar and Sen，2004；Garcia et al.，2006)；第三，活化细胞2`，5`-寡聚核酸酶(2`，5`-OAS)，使细胞产生大量的2`，5`-Oligo A，从而激活内切核酸酶L(RNase L)，水解入侵病毒的RNA(Samuel，2001)；第四，干扰素启动RNA编辑(RNA editing)机制。ADAR是一种由干扰素诱导的特异RNA的腺苷酸脱氨酸酶，通过催化腺苷酸C6的脱氨基作用，使腺苷酸(A)转化成次黄嘌啉(I)，导致dsRNA结构中稳定的AU配对变成IU组合。在翻译过程中密码子中的I很容易被当作G而改变蛋白质的氨基酸组成，使病毒的基因携带的遗传信息产生错误，无法成功翻译出正确的有正常功能的病毒蛋白(Samuel，2001)。1965年，在哺乳类发现干扰素8年后，Gravell和Malsberger首次在传染性胰腺坏死病毒(IPNV)诱导的鱼类培养细胞FHM中检测到鱼类干扰素活性。虽然此后在多种鱼类发现了鱼类干扰素的存在，鱼类病毒性疾病问题的解决也因此一度展现出美好前景(Eaton，1990)，但不幸的是，当人类干扰素的研究从实验室的基础探索走向临床应用时，鱼类干扰素的研究和应用一直没有大的进展。申请人在1996年也开始了鲫鱼干扰素的研究工作。草鱼出血病病毒(GCHV)是我国分离的第一种鱼类病毒，主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率可达60％以上。GCHV也能够感染如青鱼、麦穗鱼、稀有鮈鲫等其他多种鱼类。我们在早期发现，紫外线灭活的GCHV能高效诱导鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)产生干扰素(王铁辉等，1999；张义兵等，2000)，在此工作基础之上，申请人利用建立的实验系统，克隆鉴定了鲫鱼干扰素基因，表达特征分析表明为鱼类I型干扰素。利用鲫鱼干扰素基因的原核表达蛋白作用于鱼类培养细胞，证明能保护细胞抗GCHV感染。基因转染实验获得稳定转染干扰素基因的细胞株，抗病毒实验同样表明干扰素基因的表达产物能有效抑制病毒在细胞中的复制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鱼类干扰素基因的核苷酸序列和氨基酸序列。在病毒感染的细胞中，该干扰素基因能显著表达，并表现出类似于哺乳类干扰素基因的表达特征。实验证明该基因在鱼类抗病毒免疫反应中的具有重要作用。本专利技术的另一个目的涉及该鱼类干扰素基因的原核表达蛋白在制备治疗或预防鱼类病毒感染的药物中的应用。本专利技术再一个目的涉及该鱼类干扰素基因在鱼类培养细胞中制备治疗或预防鱼类病毒感染的药物中的应用。本专利技术还有一个目的涉及该鱼类干扰素基因在鱼类机体中制备治疗或预防鱼类病毒感染的生物制剂中的应用。本专利技术还涉及鱼类干扰素基因的表达产物在鱼类机体中制备治疗或预防渔用饲料中的应用。哺乳类干扰素抗病毒作用机制的研究证明，干扰素是抵抗病毒入侵的第一道防线。因此，当哺乳类干扰素基因被成功克隆后，利用基因工程的方法，哺乳类干扰素得到了大量的制备，并迅速运用到各种病毒病的防治中。鱼类受病毒感染后也产生干扰素，但是长期以来，鱼类干扰素基因的克隆鉴定研究一直没有突破，限制了鱼类干扰素在生产实践中的应用。可见，成功克隆鉴定干鱼类干扰素基因，并证实鱼类干扰素在培养细胞中的抗病毒作用是将鱼类干扰素作为渔用抗病毒药物和药用饲料添加剂推向市场的重要前期步骤。申请人在已经建立的一个有效的实验系统中，以感染GCHV的鲫鱼囊胚培养细胞建立了一个SMAR cDNA文库，从该文库中克隆出鲫鱼干扰素基因，同时进行序列分析、病毒诱导干扰素的表达特征分析，最后对干扰素基因原核表达蛋白和真核表达产物在培养细胞的抗病毒效果进行了检测。本专利技术介绍了一种制备鲫鱼干扰素基因的方法，同时利用原核表达技术和基因转染技术证明鲫鱼干扰素基因的表达产物诱导鱼类细胞的抗病毒状态，抑制病毒在细胞中的复制。本专利技术采用了以下技术方案1鱼类干扰素基因的克隆鉴定经过多年的研究，申请人发现，GCHV病毒经紫外线灭活后，能高效诱导鲤科鱼类培养细胞产生干扰素，表明鱼类干扰素基因在病毒诱导后已经表达。因此，本专利技术首先将GC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的基因，其序列为ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张义兵，桂建芳，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]