人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品技术

人白介素－１１（ＩＬ－１１）与人血清白蛋白（ＨＳＡ）的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠ＰＣＲ技术，连接ＩＬ－１１ｃＤＮＡ和ＨＳＡ　　ｃＤＮＡ，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＩＬ－１１ｃＤＮＡ融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明专利技术的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少８５％序列同源的第一区和与人白介素－１１至少８５％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人白介素－１１的生理特性的基础上，延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
人白介素－１１与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是从人骨髓基质细胞中分离细胞，提取ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ反转录扩增得到ＩＬ－１１ｃＤＮＡ；通过ＰＣＲ从人胎肝ｃＤＮＡ文库中扩增获得ＨＳＡｃＤＮＡ；利用重叠ＰＣＲ技术，连接ＩＬ－１ １ｃＤＮＡ和ＨＳＡｃＤＮＡ，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＩＬ－１１ｃＤＮＡ融合基因插入到克隆载体；ＨＳＡ－ＩＬ－１１ｃＤＮＡ融合基因在宿主系统中进行表达，ＨＳＡ－ＩＬ－１１ｃＤＮＡ融合基因被整合到宿主的染色体中； （１）ＩＬ－１１－ｃＤＮＡ克隆以ＲＴ－ＰＣＲ反转录得到的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ第一链为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＩＬ－１１ｃＤＮＡ，所用的引物如下：Ｐ１：５’－ＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＣ ＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣ－３’Ｐ２：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’ＰＣＲ方法如下：５０μｌ的反应体系中加入：１０μｍｏｌ／Ｌ的Ｐ１和Ｐ２的引物各１．５μｌ，２ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴ Ｐ５μｌ，１０×ｐｆｕＢｕｆｆｅｒ５μｌ，５Ｕ／μｌ的ｐｆｕＤＮＡ聚合酶０．５μｌ，ＩＬ－１１ｃＤＮＡ第一链１μｇ，加双蒸水补齐５０μｌ，ＰＣＲ条件为：９４℃变性５分钟，５５℃退火３０秒，７２℃延伸４５秒，循环２８次，最 后７２℃延伸５分钟；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用ＰＣＲ片段胶回收试剂盒纯化出０．５ｋｂ的目标片段，对目标片段产物进行Ｔ－Ａ克隆到ｐＭＤ１９Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ中，重组质粒命名为ｐＭＤ－ＩＬ－１１；（ ２）ＨＳＡ－ｃＤＮＡ的克隆：利用ＰＣＲ从人胎肝ｃＤＮＡ文库中扩增出ＨＳＡｃＤＮＡ，所用的引物为：ＰＨ１：５’－ＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣ－３’ＰＨ２：５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴ ＴＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴ－３’ＰＣＲ方法如下：５０μｌ的反应体系中加入：１０μｍｏｌ／Ｌ的ＰＨ１和ＰＨ２的引物各１．５μｌ，２ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ５μｌ，１０×ｐｆｕＢｕｆｆｅｒ１μｌ，５Ｕ ／μｌ的ｐｆｕＤＮＡ聚合酶０．５μｌ，人胎肝ｃＤＮＡ文库１μｇ，加双蒸水补齐５０μｌ；ＰＣＲ条件为：９５℃变性５分钟，９４℃变...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李华钟，金坚，段作营，孙慧碧，张莲芬，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]