本发明专利技术涉及一种转导肽－人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白以及含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明专利技术还涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明专利技术还涉及所述融合蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于恶性肿瘤放、化疗后所致的白细胞减少症、骨髓移植、再生障碍性贫血和某些存在白细胞低下的免疫缺陷性疾病的治疗，以及创伤愈合、抗病毒、抗真菌等治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有药用价值的融合蛋白，具体为转导肽-人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白，编码该融合蛋白的核酸分子。本专利技术也涉及含有该融合蛋白的药物组合物。
技术介绍
概述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)是主要的造血生长因子之一，可刺激早期多能造血干细胞和粒-单系祖细胞的增殖与分化；增强成熟中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核-巨噬细胞功能；协同刺激红系、巨核系及高增殖潜能祖细胞(HPP-CFC)生长；延长巨噬细胞存活时间及提高其抗肿瘤能力；同时，GM-CSF还能刺激内皮细胞生长，阻止多种细胞凋亡，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF还可以促进树突状细胞(DC)等APC分化、成熟和活化及上调CD86的表达以激发对肿瘤的免疫应答；促进Th、Tc、NK在肿瘤部位浸润，从而杀伤肿瘤。作为一个多潜能的造血生长因子，它的主要临床应用是促进骨髓造血，目前在临床上rhGM-CSF已成功地用于治疗恶性肿瘤放、化疗后所致的白细胞减少症，以及用于骨髓移植、再生障碍性贫血和某些存在白细胞低下的免疫缺陷性疾病的治疗等。近些年的研究发现，GM-CSF不仅能够作用于造血干、祖细胞促进骨髓造血，而且还作用于目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞-树突状细胞，以促进免疫应答，调节免疫反应。另外，GM-CSF还作用于角质细胞、成纤维细胞、黏膜细胞等。近年来许多文献报道，rhGM-CSF不但能够用于防治白细胞减少症，而且在创伤愈合、抗病毒、抗真菌等治疗中也有着很好的疗效，具有重要的临床应用价值。GM-CSF的性质GM-CSF是一种酸性糖蛋白。hGM-CSF基因定位于5号染色体长臂(5q21-32)，基因长度为2.5kb，有4个外显子和3个内含子。hGM-CSF是一种由127个氨基酸组成的糖蛋白，根据其糖基化程度不同，分为9个以上不同的类型，分子量14kD-32kD。其二级结构由两个反向平行的β折叠和4个反向平行的α螺旋组成，N端第一螺旋是GM-CSF受体β亚基的识别区。四个半胱氨酸残基形成两个链内二硫键(C54，C96)和(C88，C121)，对GM-CSF的稳定性和生物活性起重要作用。目前已知，GM-CSF的生物学功能乃是通过表达于细胞膜上的特异性受体而介导。GM-CSF通过与受体结合，激活靶细胞上Na+/H+转换载体活性，提高细胞内pH数值，从而引导细胞增值分化。GM-CSF的靶细胞主要有骨髓不同发育阶段的造血细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸粒细胞、内皮细胞、急性髓性白血病细胞等。GM-CSF的表达体系利用重组克隆的方法在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞系统中成功表达了GM-CSF。在大肠杆菌中的表达方式主要为两种(1)包涵体形式，GM-CSF在大肠杆菌中表达最常见的是形成不溶性的包涵体，经提取包涵体、变性裂解、复性、纯化等步骤得到GM-CSF。(2)分泌型表达，即利用外膜蛋白信号肽(OmpA)基因，将GM-CSF基因克隆到OmpA基因后面，用定位突变的方法去除二者间的连接序列，得到成熟的GM-CSF，但表达量不高，每升发酵液仅20mg左右。GM-CSF在酵母系统中的表达，是将GM-CSF基因克隆到α-因子信号肽基因下游，用定位突变的方法去除GM-CSF与α-因子信号肽间的连接序列，在ADHZ，PGK等启动子调控下，于酵母中表达并分泌到胞外，表达量可高达每升发酵液50-60mg。GM-CSF在哺乳动物细胞体系如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和猴COS-1细胞中进行了表达，但表达量甚微。上述三种体系表达的GM-CSF，其主要区别是N-位点及O-位点的糖基化。大肠杆菌表达的GM-CSF(E.coli-GM)，N-位点和O-位点均未糖基化，分子量为14.6kD；酵母表达的GM-CSF(Yeast-GM)，仅N-位点糖基化，而O-位点未糖基化，分子量15.6-30kD；哺乳动物细胞表达的GM-CSF(CHO-GM)，N-位点和O-位点均被糖基化，分子量18-24kD。体外实验表明糖基化与非糖基化GM-CSF在生物学活性方面无明显差异。临床应用方面，Dorr比较了E.coil-GM和Yeast-GM的毒副作用，结果E.coil-GM组出现液体滞留，呼吸困难，发烧，肌痛/骨痛/关节痛和斑疹的平均频率分别为18.4％，55.2％，40.7％，28.5％和12.5％，Yeast-GM组相对应分别为8.3％，13.4％，21.7％，16％和14.3％。表明Yeast-GM毒副作用较轻。Hussein等将E.coil-GM，Yeast-GM和CHO-GM分别用于自体骨髓移植后的乳腺癌或黑色素瘤病人，结果在升高白细胞和中性粒细胞的恢复方面，E.coli-GM和Yeast-GM明显高于CHO-GM，而CD34+细胞数量，CHO-GM组最高，Yeast-GM组又高于E.coil-GM。其作用机理仍需进一步探讨。GM-CSF的生物学作用GM-CSF主要有以下的生物学作用能在造血干细胞和祖细胞水平有效刺激粒细胞和单核-巨噬细胞系增殖、分化和成熟。体外半固体培养中可有效刺激正常髓系多向造血祖细胞、粒/巨噬细胞和嗜酸粒细胞克隆形成。还具爆式促进因子(BPA)的活性，与GM-CSF协同促进爆式红系集落形成单位形成。GM-CSF也能促进巨核系细胞生长和血小板的生成。还刺激某些白血病细胞(HL 60和KG 1)增殖生长，诱导HL 60细胞向成熟方向分化。骨髓内皮细胞是造血微环境的基质细胞之一，对造血有重要调控作用，外源性GM-CSF可刺激其增殖。GM-CSF不仅可刺激未成熟前体细胞的增殖，还可提高成熟血细胞的功能，延长其生存期，在调节成熟血细胞功能中似乎起中心作用。GM-CSF对中性粒细胞的作用主要表现为增加蛋白质合成，延长生存期；促进ADCC作用；改变细胞表面受体表达，抑制其在炎症区的移动；上调细胞表面黏附蛋白表达，诱导胞浆内脱颗粒作用；增强氧化代谢，增加超氧化物产生；加速Ca2+流，诱导游走，增加LTB4合成。还可增强单核巨噬细胞的吞噬、细胞毒和杀伤肿瘤细胞的作用，促进细胞因子的表达、黏附及氧化代谢。对嗜酸粒细胞主要是增强细胞毒作用及白三烯合成、组胺释放。此外，多种非造血起源的肿瘤细胞系对GM-CSF也有敏感反应。GM-CSF是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用。在调节造血和白细胞功能中有重要作用，能刺激骨髓祖细胞增殖和分化，刺激中性、嗜酸性粒细胞、MΦ及DC增殖和成熟；也可促进巨核细胞生长。对红细胞生长有辅助调节作用，有促红细胞、网织红细胞作用，提高单核巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，增加粒细胞数目，提高黏附分子表达及ADCC杀瘤作用，减少感染机会，提高免疫力，尤其具有增强机体肿瘤免疫的功能。临床应用GM-CSF是诸多造血因子中重要一员，自90年代应用于临床以来，特别是肿瘤放疗、化疗所致的白细胞减少、骨髓移植、骨髓异常增生综合征、再生障碍性贫血等治疗取得了一定疗效。近年来的临床应用中又发现对放、化疗所致黏膜炎、真菌感染、病毒性肝炎、糖尿病合并脂肪渐进性坏死的不愈性小腿溃疡和肺泡蛋白沉积症等亦有较好的疗效。1、肿瘤放本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其含有转导肽和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李前，孙曼霁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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