一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体制造技术

本发明专利技术公开了一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体，表达载体pET‑32a(+)中插入了如SEQ ID № 1所示的核苷酸序列，该序列插入在pET‑32a(+)骨架中Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ的两个酶切位点间。所述转移载体含有禽痘病毒早晚期启动子P7.5控制之下的MDPV VP1基因、P11启动下的报告基因EGFP以及用于同源重组的鸽痘病毒基因组的TK非复制区片段；同时，利用本发明专利技术重组鸽痘病毒转移载体构建的重组鸽痘疫苗毒株在动物体内可高效表达重组疫苗，具有较好的免疫保护效果。

A recombinant VP1 gene of Muscovy Duck Parvovirus Pigeonpox virus transfer vector

【技术实现步骤摘要】
一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体
本专利技术涉及生物

技术介绍
番鸭细小病毒是雏番鸭的一种急性传染病。病理变化是纤维素性肠炎、胰脏呈点状坏死，以3周龄内的雏番鸭多发，最早是3日龄发病。病鸭张口呼吸、喘气，消瘦、拒食、蹲伏，十二指肠内容物呈松散栓子状，表层有脱落的黏膜附着。(1)发病特点在自然情况下仅雏番鸭发病，流行期间同地饲养或放牧的雏鸭、雏半番鸭、雏鹅和雏鸡等从未见有感染发病。雏番鸭l～5周龄为易感日龄，7～20周t龄最易感。(2)症状患病雏番鸭精神沉郁、厌食、怕冷、软脚、喜蹲、喘气、张口呼吸，喙发绀，显著消瘦。粪便稀薄呈灰白或灰黄色。患病后期角弓反张及腿部瘫痪，病程2～7天。少数病愈雏番鸭大多成为生长不良的僵鸭，出现个体小、消瘦、掉羽等症状。(3)剖检特征患病雏番鸭的胰腺苍白，局部充血，表面有数量不等的针头大灰白色坏死点。心脏色泽苍白，心肌松软。胆囊肿大。肠黏膜有不同程度的充血和出血，呈卡他性炎症，尤以十二指肠、空肠和回肠病变为甚。多数病例在小肠的中段和下段，特别是在靠近卵黄柄和回盲部的肠段，外观变得极度膨大，呈淡灰白色，形如香肠状，手触肠段质地很坚实。从膨大部与不肿胀的肠段连接处可以很明显地看到肠道被阻塞的现象。膨大的肠段有的病例仅有1处，有的病例见有2～3处，每段膨大部长短不一。脑壳、脑组织充血。目前已有预防该病的弱毒疫苗，但实际生产中，弱毒疫苗易受母源抗体水平的干扰，影响雏番鸭的免疫预防效果，且弱毒疫苗还存在毒力返强的危险。
技术实现思路
本专利技术提供一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体，其具有优异的免疫保护效果。一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体，表达载体pET-32a(+)中插入了如SEQID№1所示的核苷酸序列，该序列插入在pET-32a(+)骨架中KpnⅠ和SacⅠ的两个酶切位点间。所述载体是通过步骤：1)扩增重组臂、2)重叠延伸PCR、3)构建质粒pTK、4)人工合成反向串联表达盒片段S、5)构建质粒pTKS、6)PCR扩增VP1片段、7)构建载体pTKS-VP1-EGFP，即可获得番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术将番鸭细小病毒(MDPV)的VP1基因重组到鸽痘病毒中，构建鸽痘病毒转移载体。构建的载体含有禽痘病毒早晚期启动子P7.5控制之下的MDPVVP1基因、P11启动下的报告基因EGFP(增强绿色荧光蛋白)以及用于同源重组的鸽痘病毒基因组的TK非复制区片段。本专利技术为研制高效的番鸭细小病毒重组鸽痘病毒活载体疫苗奠定了基础。2)利用本专利技术重组鸽痘病毒转移载体构建的重组鸽痘疫苗毒株在动物体内可高效表达重组疫苗，具有较好的免疫保护效果。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：载体制备方法。1)扩增重组臂：以鸽痘病毒的基因组为模板，扩增左右同源臂TKL片段和TKR片段；2)重叠延伸PCR：以上述获得的TKL和TKR片段为模板进行重叠延伸PCR；3)构建质粒pTK：将TK片段连入pET-32a(+)质粒中，获得pTK质粒；4)人工合成反向串联表达盒片段S，依次含有早期启动子P7.5、多克隆位点MCS1、终止子SV40、反向多克隆位点MCS2、晚期启动子P11；5)构建质粒pTKS：表达盒片段S连入质粒pTK中，获得pTKS质粒；6)PCR扩增VP1片段；7)构建载体pTKS-VP1-EGFP：将VP1片段、EGFPBGHpA片段分别插入pTKS质粒的多克隆位点MCS1、反向多克隆位点MCS2中，即可获得载体pTKS-VP1-EGFP，即为番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体。实施例2：对pTKS-VP1-EGFP进行效果检测。一、重组鸽痘病毒提取实施例1中制备的重组载体pTKS-VP1-EGFP，提取方法参照QIAprepMiniprep说明书进行。制备CEF细胞，待CEF细胞长到80％单层，用鸽痘病毒疫苗株FPV-F10感染，37℃感作2h，然后倒掉感染液，洗涤细胞后，然后将重组载体pTKS-VP1-EGFP进行转染。转染程序按LipofectaminePlusReagent使用说明进行。在细胞病变达到80％时收毒，反复冻融三次，用于筛选重组鸽痘病毒。在37℃、5％CO2培养4-6h，更换新鲜的含2％FCS的MEM，继续培养48-72h，于荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。收获以上具有荧光的病毒，反复冻融，裂解细胞后，低速离心，取上清提取重组鸽痘病毒基因组，方法参照上海生工的《UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒》说明书。以提取的鸽痘病毒基因组为模板，用VP1基因扩增引物VP1-F、VP1-R进行鉴定，以野生型盲传10代的疫苗毒作为对照扩增出一条长度为1625bp的条带，证明VP1基因已重组到鸽痘病毒基因组中。二、绿色荧光蛋白表达的检测重组质粒pTKS-VP1-EGFP的纯化参照WizardPurifectionPlasmid使用说明。在转染时采用亲本病毒感染CEF后，用质粒转染细胞，在转染后的第3天，将转染的细胞拿到荧光显微镜下观察。结果发现在重组质粒pTKS-VP1-EGFP转染的感染FPV亲本毒的CEF细胞中可以看到绿色荧光，非病毒感染细胞没有荧光出现，说明重组鸽痘病毒可以识别启动子使EGFP基因获得表达。三、免疫效果检测本专利技术还初步研究了利用本专利技术重组鸽痘病毒转移载体构建的重组鸽痘病毒在动物体内的免疫效果，结果发现该重组鸽痘病毒在动物体内可正常表达并产生较好的免疫保护。SEQUENCELISTING<110>佛山科学技术学院<120>一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体<130>2017<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1805<212>DNA<213>人工序列<400>1tagggcgaattgggtaccacgatgaaaaaacatttgtctttgtcaaattttagtatctaa60atggatagaaatatcaattttagtcctgtatttatagaacctaggtttaaacacgagttt120ctattatctcctcaaaggtatttttatatattagtttttgaagtaatagtagctttgatt180atattgaattttttctttaaggaagaaatattatatacattttttccgttagctaagcct240tctaaaaattcaataaatagt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体，其特征在于：表达载体pET‑32a(+)中插入了如SEQ ID №1所示的核苷酸序列，该序列插入在pET‑32a(+)骨架中KpnⅠ和SacⅠ的两个酶切位点间。

【技术特征摘要】
1.一种番鸭细小病毒VP1基因重组鸽痘病毒转移载体，其特征在于：表达载体pET-32a(+)中插入了如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛森，曹梦蕊，李荣绪，陈建红，张济培，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44