纳豆激酶的制造方法技术

本发明专利技术为一种纳豆激酶的制造方法，其包括如下步骤：发酵，将纳豆激酶从纳豆菌中释放出来，发酵液中含有纳豆激酶及菌体；将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的纳豆激酶；将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液；以及，纯化所述上清液，获得纯化后的纳豆激酶溶液。采用本发明专利技术的纳豆激酶的制造方法，可有效提升纳豆激酶的回收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种纳豆激酶(nattokinase)的制造方法。技术背景血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率及死亡率居各种 疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。但当前的溶栓剂，如尿 激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等，存在半衰期短、副作用大、 价格昂贵等各种缺点，难以成为适用的大众药品。1987年须见洋行在日本 的传统发酵食品纳豆中发现了 一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激 酶(Nattokinase, NK)。研究表明，纳豆激酶是一种丝氨酶蛋白酶(丝氨酸 蛋白酶)，能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间 (Euglobulinlysis time, ELT),并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂 (t-PA)，从而更有效地发挥溶栓效果。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新 型口服溶栓药物。目前，纳豆激酶的分离纯化工艺常采用传统的蛋白质纯化方法，如 有机溶剂沉淀、盐析、离心、凝胶色谱、疏水色谱、离子交换色镨等纯化 方法。从固体发酵纳豆中分离纯化纳豆激酶的一种先前技术的工艺为生 理盐水抽提纳豆激酶，加入硫酸铵(硫酸氨铵)在25%饱和度下过夜，再 于4°C ， 7000转/分钟离心40分钟，收集上清上5Butyl-Toyoperal疏水柱， 收集活性峰再次进行饱和度25%的硫酸铵沉淀，取上清进行饱和度60%的 硫酸铵沉淀，然后上CM-Toyopearl离子交换柱，收集活性峰再上 Sephadex-G50,收集活性峰并透析过夜。采用上述工艺制造纳豆激酶，收率 低，最终获得的产品很少。1998年5月12日公告的第5,750,650号美国专利揭露了另一种分离纯 化纳豆激酶的方法从发酵液中提取纳豆激酶时，采用无水乙醇沉淀、Butyl Sepharose柱层析、脱盐浓缩后过阴离子交换柱(Mono-Q )，洗脱液再上疏 水层析柱(Alkyl Sepharose )得到回收率为22.0%的纯纳豆激酶。采用此方 法来分离纯化纳豆激酶虽然一定程度上提高了纯纳豆激酶的回收率，但回 收率依然很低。
技术实现思路
本专利技术提供了 一种回收率较高的。本专利技术提供一种，其包括如下步骤发酵，将纳 豆激酶从纳豆菌(natto bacilli)中释放出来，发酵液中含有纳豆激酶及菌体； 将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的 纳豆激酶；将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液；纯化所述上清液， 荻得纯化后的纳豆激酶溶液。本专利技术提供的中，包括了细胞破碎的步骤，即将 纳豆菌细胞的细胞壁破碎，将细胞壁破碎后，可以将在发酵过程中被卡在 纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来。因此，相较于先前技术的纳豆激酶 的制造方法，本专利技术提供的可较大程度上提升纳豆激 酶的回收率。而且，针对同一发酵方法，本专利技术提供的纳豆激酶的制造方 法可将纳豆激酶的回收率提升40~ 50%。具体实施方式本专利技术所提供的主要包括发酵、细菌破碎、离心 (去除残渣)、精制(或称为纯化)等步骤，下面将逐步详述。 本专利技术所提供的第一实施方式详述如下。 1 )发酵从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10毫升的种子培养基 中，150转/分钟(rpm)下摇床培养8小时，按1%接种量接入发酵培养基 中，再于28。C、 150转/分钟下发酵罐培养100小时。发酵过程中，纳豆激 酶会从纳豆菌中释放出来，液体中含有纳豆激酶及菌体。2)纟田』包石皮;争如上所述，在发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来。经研究 表明，发酵只能释放出纳豆菌中所含有的部分纳豆激酶，约有50%左右的 纳豆激酶受到纳豆菌细胞的细胞壁的阻碍，会卡在纳豆菌细胞的细胞壁而未能从纳豆菌细胞中释放出来，因此现有技术无法利 用卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶，因此，总是无法达到理想的回收率。为解决此问题，本专利技术提供了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细 胞壁;皮^争。将细胞壁;皮石卒后，可以将先前4支术中一皮卡在纳豆菌细力包壁的納 豆激酶均释放出来，因此，可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。本专利技术提供的细胞破碎步骤的第一种实施方式为瞬间(一般为1秒 以内)改变发酵液所处环境的压力，例如，可瞬间提升至2000磅/平方英寸 (Psi)再瞬间降至常压，以使纳豆菌细胞壁破碎，此步骤重复进行，以使 纳豆菌细胞充分破碎。3) 离心用冷冻离心机将发酵液于0。C下以2000转/分钟(rpm)的速度离心8分钟，收集上清液，于上清液中加入10。/。饱和度的硫酸铵(NH4)2S04沉淀，2000转/分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至60%的饱和度， 2000转/分钟离心收集沉淀，将沉淀重悬于IO毫摩尔浓度、pH值为6的磷 酸緩沖液中，2000转/分钟离心10分钟收集上清液，于0。C保存备用。4) 精制，即纯化用层析系统将上清液以10公分/小时(cm/h )的线速度加入凝胶层析柱 中，用10毫摩尔浓度(mM)的磷酸緩冲液以相同的线速度洗涤至出峰完 毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积 为9毫升处的洗脱液，收集液体积为3毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。5) 制成高纯度纳豆激酶产品将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐16小 时后，置于-2(TC冰箱下冷冻12小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为24小 时，即可得到高纯度的纳豆激酶产品。本专利技术所提供的第二实施方式详述如下。1) 发酵从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入200毫升的种子培养基 中，300转/分钟(rpm )下摇床培养25小时，按5%接种量接入发酵培养 基中，再于37。C、 300转/分钟下发酵罐培养150小时。2) 细胞破碎本实施方式中，细胞破碎的步骤为将发酵液反复冷冻，将温度降至-rc以下，形成水冰晶，以刺破纳豆菌细胞壁。3) 离心用冷冻离心才几将发酵液于20°C下以10000转/分钟的速度离心15分钟， 收集上清液，于上清液中加入40。/。饱和度的硫酸铵(NH4)2S04沉淀，10000 转/分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵(NH4)2S04至85%的饱 和度，10000转/分钟离心30分钟收集沉淀，将沉淀重悬于100毫摩尔浓 度、pH值为8的磷酸緩沖液中，10000转/分钟离心收集上清液，于20。C保 存备用。4) 精制，即纯化用层析系统将上清液以100公分/小时(cm/h)的线速度加入凝胶层析 柱中，用200毫摩尔浓度的磷酸緩冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕， 用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为15 毫升处的洗脱液，收集液体积为6毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。5 )制成高纯度纳豆激酶产品将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐32小 时后，置于-2(TC水箱下冷冻24小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为48小 时，即得到高纯度的纳豆激酶产品。本专利技术所提供的第三实施方式详述如下。1 )发酵从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入50毫升的种子培养基 中，240转/分钟(rpm)下摇床培养10小时，按4%接种量接入发酵培养基 中，再于30。C、 220转/分钟下发酵罐培养120小时。2) 细胞破碎本实施方式中，细胞破碎的步骤为于发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳豆激酶的制造方法，其包括：　　　　发酵，将纳豆激酶从纳豆菌中释放出来，使发酵液中含有纳豆激酶及纳豆菌细胞；　　　　将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的纳豆激酶；以及　　　　将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液以制得纳豆激酶溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志翼，郑俊明，杨文仁，
申请(专利权)人：人宇生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]