多靶点miRNA反义核苷酸技术制造技术

多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术，本发明专利技术涉及一种反义核苷酸技术。他是为了解决现有沉默ｍｉＲＮＡｓ的方法存在靶向性单一，作用效力差的问题。多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术通过以下方法实现：一、通过基因芯片筛选或文献提供，找到可调节关键基因即致病基因的ｍｉＲＮＡ；二、将多条反义核苷酸设计到一个能同时沉默多个靶ｍｉＲＮＡｓ的单条核苷酸序列中，即实现多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术。本发明专利技术可以作为一种简单而直接的方法，可对其它包含多种ｍｉＲＮＡ及多种基因的生物过程进行研究。ＣＡＭＯ方法与现有方法相比较其最大优势在于，可以使一个药物分子调节多个靶向基因，作用效果更加显著，解决了现有方法靶向性单一，作用效力差的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种反义核苷酸技术。
技术介绍
反义核苷酸是一段与mRNA或DNA特异性配对结合从而阻断其基因表达 的人工合成的RNA或DNA分子。反义核苷酸能通过封闭或抑制肿瘤细胞和 病毒的关键编码基因来特异性抑制细胞增殖和病毒的复制，是治疗肿瘤、病毒 性疾病和其它相关疾病的新型药物。目前正在进行研究的反义核苷酸药物有 IO余种，其中抗肿瘤作用的有7种，抗病毒作用的l种，其它如作用于心血 管、代谢、免疫及细胞粘附系统的有4种。疾病的发生，往往是几个或多个基 因综合作用的结果，目前这些反义核苷酸药物设计均是针对某个单一致病基因 或某个调节病毒基因蛋白表达(酶)的关键序列来设计的。微RNAs (miRNAs) 的发现改变了我们对调节基因表达机制的理解。根据miRNAs在基因组中的数 量(预计在人类基因中含量>1%，调节1~10%的基因)和表达水平(一些miRNAs 在每个细胞中的拷贝数>1000)说明miRNAs在人体内是一种含量丰富的RNA 种类。而且每个miRNA具有调节数百个mRNAs的潜能；因此miRNAs在细 胞中有广泛的功能。目前已证明包括癌症在内的一系列人类疾病中miRNAs 是这些疾病新的治疗靶点。因此，沉默miRNAs最有效的途径是利用miRNA 的反义核苷酸。根据疾病中miRNAs功能变化针对性的设计反义核苷酸药物进 行干预，这是在miRNAs研究和miRNAs治疗中一种基本的途径。这些miRNA 反义核苷酸的结合具有特异性、剂量依赖性，有效性和不可逆性。这个方法已 被用来鉴定miRNAs的许多细胞学功能，且人们已经相信它是治疗疾病的一种 合理的对策。目前沉默miRNAs的主要方法为Anti-miRNA反义抑制剂 (Anti-miRNA antisense inhibitors or anti-miRNA oligonucleotides, AMO )方法， 但该方法存在耙向性单一，作用效力差的问题。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有沉默miRNAs的方法存在靶向性单一，作用效力差 的问题，而提出了多靶点miRNA反义核苷酸技术。多耙点miRNA反义核苷酸技术通过以下方法实现 一、通过基因芯片筛选或文献提供，找到可调节关键基因的miRNA; 二、根据所选定的多个靶miRNA，人工合成所选定靶miRNA 各自的反义核苷酸链，称为反义单元；三、将不同的靶miRNA的反义单元设 计到一个能同时沉默多个靶miRNAs的单条核苷酸序列中，即实现多靶点 miRNA反义核苷酸技术。本专利技术将针对不同miRNA为靶标的多个反义核苷酸 整合到单一核苷酸片段中，这种片段对miRNAs具有多靶向性——复合 miRNAs (combined anti-miRNA oligonucleotides, CAMO)，它是寻找miRNAs 耙点和研究miRNAs功能的一种改良途径，这主要是由于CAMO的"单片段-多耙点"方法可以是携带重复的同一反义单元的同型体或者是携带多种耙向不 同miRNA的反义单元的异型体。由于一个特定的mRNA被多种miRNA调节， 为了获得基因的最佳干扰效果需要同时靶向多种miRNA，而本专利技术可以做到 这一点，这是CAMO方法优于AMO方法之处。由于不同目的需要多种不同 反义单元集合的组合，CAMO为此提供了一个具有创新和理性设计的方法， 为确认和鉴别miRNA的靶点和它们在基因调控过程中的作用等功能分析中提 供了一种精密的工具。本专利技术可以作为一种简单而直接的方法，可对其它包含 多种miRNA及多种基因的生物过程进行研究。CAMO方法与现有方法相比较 其最大优势在于，可以使一个药物分子调节多个靶向基因，作用效果更加显著， 解决了现有方法靶向性单一，作用效力差的问题。 附图说明图1 a是结合序列片断嵌入到HEK293细胞中的荧光素酶基因的3' UTR 上的基因片段图，图l b是CAM021/155/17和规则的AMO消除抑制效应的 对比图，图lc是CAM01/133和规则的AMO消除抑制效应的对比图；图2a 是在人乳腺癌细胞MCF-7中导入CAM021/155/17与分别导入miR-21， miR-155和miR-17-5p的三种反义核苷酸片段的肿瘤抑制基因的TGFBI， APC 和BCL2L11的增加情况对比图，图2 b是在离体的新生鼠心室肌细胞中 CAMOl/133转染增加HCN2蛋白水平和AMOl与AM0133共转染增加HCN2 蛋白水平的对比图，图2c是消除3'UTRs和miRNAs相互作用结果后荧光素 酶活性表达图，图2d是用CAMOl/133沉默HCN2和CACNA1C基因3' UTRs 后和miRNAs相互作用结果后荧光素酶活性表达图，图2e是本专利技术在MCF-7 细胞系中对细胞生存能力的影响图，图2f是CAMOs的靶miRNAs相互作用 的结果图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式中多靶点miRNA反义核苷酸技术通过以下 方法实现 一、通过基因芯片筛选或文献提供，找到可调节关键基因的miRNA; 二、根据所选定的多个靶miRNA，人工合成所选定靶miRNA各自的反义核苷 酸链，称为反义单元；三、将不同的靶miRNA的反义单元设计到一个能同时 沉默多个靶miRNAs的单条核苷酸序列中，即实现多耙点miRNA反义核苷酸 技术。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二的多 个为2 5个。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中将 不同目标miRNA的反义单元设计到一个能同时沉默多个耙miRNAs的单条核 苷酸序列中是通过以下方法实现的用一条八个核苷酸的链来连接两个不同目标miRNA的反义单元，其中八个核苷酸的链的两端分别连接于两个不同的目 标miRNA的反义单元的5'和3'，反义单元两端的五个核苷酸由亚甲基桥锁 定。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式三的不同点在于八个核苷酸 的链为CTTAAATG。其它步骤与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式举出实例证明本专利技术，本实施方式通过以下 方法实现现在MiR-21、 miR-155、和miR-17-5p被证明为致癌miRNAs，它 们在一些实体瘤中过度表达，miR-l和miR-133是决定肌肉特性的miRNAs， 分析测定出它们使各自目标miRNAs失活的能力，将一条有5个耙miRNAs 的结合序列(miR-21， miR-155， miR-17-5p, miR-l and miR-133)的片断嵌入到 HEK293细胞中的荧光素酶基因的3' UTR上。本实施方式中将有5个耙miRNAs结合序列(miR-21， miR-155， miR-17-5p， miR-l andmiR-133)的片断嵌入到HEK293细胞中的荧光素酶基因的3'UTR上 是通过以下方法实现的如图la所示用一条八个核苷酸的链接(加下划线标记)来连接两端的反义单元，两端的五个核苷酸由亚甲基桥锁定；每一个反义单元(大写粗体)5'端的八个氨基酸中插入的碱基替换突变(小写粗体)并 把突变的CAMOs列为了阴性对照。如图1 b所示CAM021/15本文档来自技高网...

【技术保护点】
多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术，其特征在于多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术通过以下方法实现：一、通过基因芯片筛选或文献提供，找到可调节关键基因的ｍｉＲＮＡ；二、根据所选定的多个靶ｍｉＲＮＡ，人工合成所选定靶ｍｉＲＮＡ各自的反义核苷酸链，称为反义单元；三、将不同的靶ｍｉＲＮＡ的反义单元设计到一个能同时沉默多个靶ｍｉＲＮＡｓ的单条核苷酸序列中，即实现多靶点ｍｉＲＮＡ反义核苷酸技术。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宝峰，王志国，吕延杰，白云龙，初文峰，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，王志国，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]