一种快速高通量的基因定点诱变方法技术

本发明专利技术提出了一种快速高通量的基因定点诱变方法，其步骤为：１．构建了一个表达ＤｐｎＩ限制性内切酶的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株；２．根据需要对基因待突变的位置进行序列分析，设计部分重叠（１０～１６ｎｔ）的ＰＣＲ诱变引物；３．反向ＰＣＲ扩增；４．扩增后的ＰＣＲ产物直接化学法转化上述构建的表达ＤｐｎⅠ的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样经过ＤｐｎⅠ体内筛选就可以得到携有预定突变的质粒。本发明专利技术能够真正做到简单快速的定点诱变，且不需订购特殊修饰的引物，不需要对ＰＣＲ后的产物进行任何处理步骤（酶切连接，体外杂交，胶回收和体外ＤｐｎⅠ的消化处理等）就能方便迅速地构建突变质粒。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种快速高通量的基因定点诱变方法，其特征在于步骤为：一、构建了一个表达ＤｐｎⅠ限制性内切酶的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株；首先通过λ－Ｒｅｄ重组酶介导的同源重组，用抗性基因替换大肠杆菌染色体上的编码ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶的基因，得到ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；其次，用ＰＣＲ的方法合成了编码ＤｐｎⅠ的基因ｄｐｎＣ，并将此基因克隆到温度敏感型的质粒载体上，构建了表达ＤｐｎⅠ的质粒；再次，将此质粒转化上述构建的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样就得到了表达ＤｐｎⅠ的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；二、设计部分重叠的ＰＣＲ诱变引物；根据需要对基因待突变的位置进行序列分析，合理设计一对ＰＣＲ诱变引物，分别称为正向诱变引物和反向诱变引物，其中在选定的位点引入了新的预定突变的核苷酸，另外这对引物在５‘端重叠１０～１６ｎｔ，这样通过反向ＰＣＲ扩增后，得到线形的携有预定突变的产物在末端就会带有１０～１６ｎｔ的同源区，在转化大肠杆菌后，依靠大肠杆菌中不依赖Ｒｅｃ－Ａ的同源重组就可以实现此ＰＣＲ产物的自环化；三、反向ＰＣＲ扩增；以上述设计的这对ＰＣＲ诱变引物，对克隆了目的基因的环状质粒模板进行反向ＰＣＲ扩增；四、扩增后的ＰＣＲ产物直接化学法转化上述构建的表达ＤｐｎⅠ的ＤＮＡ腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样经过ＤｐｎⅠ体内筛选就可以得到携有预定突变的质粒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，李静，李春华，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]