多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片及其制备方法和应用，包括对应鲍曼不动杆菌8种不同耐药基因的微球、探针、特异性引物、生物素结合的引物及链霉亲和素‑藻红蛋白，耐药基因分别是OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA；所述微球是分别与针对上述8种耐药基因的特异性探针偶联的8种微球；所述探针是针对上述8种耐药基因的氨基化的特异性探针；所述特异性引物能对上述8种耐药基因进行特异性扩增。本发明专利技术提供的液相芯片检测迅速准确、省时省力，可以同时检测并区分鲍曼不动杆菌的8种耐药基因。

Multidrug resistant Acinetobacter Bauman nucleic acid detection liquid phase chip and its preparation method and Application

The invention discloses a multi drug resistant Acinetobacter Bauman nucleic acid detection liquid and its preparation method and application of chips, including the corresponding Bauman real primers and 8 different resistance genes of Bacillus streptavidin microspheres, specific primers and probe, biotin binding streptavidin phycoerythrin protein, resistant gene were OXA23 IMP, VIM, TEM, AMPC, AAC6, GYRA, AAC3, \; said microspheres are 8 kinds of microspheres with specific probe coupling for the above 8 kinds of resistance genes; the probe is a specific probe for the above 8 kinds of resistance gene amino; the specific primer of the 8 kinds of resistance genes were amplified. The liquid chip detection provided by the invention is rapid and accurate, time saving and labor-saving, and can detect and distinguish 8 resistant genes of Acinetobacter Bauman at the same time.

【技术实现步骤摘要】
多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种多重耐药鲍曼不动杆菌液相芯片及其制备方法与应用，属于生物检测

技术介绍
2010年，随着“超级细菌”这一名词频繁地见诸报端，细菌多重耐药、抗生素的合理使用重返人们视线。超级细菌其实并非新事物，它不是一个细菌的名称，而是一类细菌的名称，这一类细菌的共性是对几乎所有的抗生素都有强劲的耐药性，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性。细菌耐药性，尤其是多重耐药性(multidrugresistance,MDR)已经成为非常严重的医疗问题及社会问题。细菌耐药机理十分复杂，在抗生素的压力选择下，临床细菌耐药状况的日益恶化。细菌耐药性的检测与监测对于正确的目标性抗感染治疗以及监测细菌耐药性变迁和耐药菌感染的流行病学调查，制定防控细菌耐药性增加的措施至关重要。然而，目前临床实验室多采用耐药表型的检测方法，其检测周期长时效性差、检测通量低、影响因素多是最主要的问题，不能满足目前临床抗感染治疗和医院感染控制的要求。液态芯片(又称流式荧光技术、液相芯片、悬浮阵列等)是在后基因组时代发展起来的新一代标准化开放式高通量技术平台，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：利用液态芯片技术，提供一种多重耐药鲍曼不动杆菌液相芯片及其制备方法与应用。本专利技术提供的多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片，包括对应鲍曼不动杆菌不同耐药基因的微球、探针、特异性引物、生物素结合的引物及链霉亲和素-藻红蛋白。鲍曼不动杆菌8种耐药基因分别是OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA。所述微球是分别与针对上述8种耐药基因的特异性探针偶联的8种微球。所述探针是针对上述8种耐药基因的氨基化的特异性探针。所述特异性引物能对上述8种耐药基因进行特异性扩增。其探针序列为其引物序列为：本专利技术还提供一种多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)微球与氨基化的探针偶联形成偶联体，分别选取8种不同荧光色的羧基微球，洗涤、活化羧基微球；以不同微球的顺序分别对应地加入针对OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA耐药基因的特异性氨基化探针；加入EDC混匀，室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；分别得到8种不同特异性探针与微球形成的偶联体；计数单位体积每种微球偶联体的数，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合。(2)将特异性探针与微球偶联的偶联体、特异性引物、活化的生物素标记的通用引物、链霉亲和素-藻红蛋白按比例配置，得到多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片。本专利技术提供的多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片在检测试剂中的应用。.将标记有探针的微球偶联体、特异性引物、作为报告分子的活化的生物素标记的通用引物、链霉亲和素-藻红蛋白按比例配置，探针与相应的目的核酸特异性的结合，带有生物素标记的报告分子也与链霉亲和素-藻红蛋白特异性的结合，将混合物上样到液相芯片分析系统，采用液相芯片分析技术将微球偶联体分为单个细胞流，利用红、绿两束激光检测，获得光信号、处理数据就可完成对生物反应的实时、定量分析。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的液相芯片检测迅速准确、省时省力，可以同时检测并区分鲍曼不动杆菌的8种耐药基因。具体实施方式实施例1：探针与已知编号的微球的偶联(1)分别选取8种不同荧光色羧基化微球，用漩涡震荡器振荡微球悬液，时间20s，使微球混合均匀。(2)分别取上述各号羧基微球大约2×103个，分别转移到离心管中，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。(3)移走上清，加入100μldH2O，用漩涡震荡器振荡20s重悬微球，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。(4)移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液，用漩涡震荡器振荡20s重悬洗涤的羧基微球。(5)加入10μl、50mg/ml的Sulfo－NHS(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。(6)加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。室温孵育20min，每隔10min用漩涡震荡器轻振一次。≥8000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。(7)移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩涡震荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球。≥8000×g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球。(8)重复步骤7两次，用50mM、pH＝5.0的MES洗涤2次。(9)加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩涡震荡器振荡20s。在混匀的微球中分别加入1nmol特异性探针，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩涡震荡器混匀。(10)在室温下放在摇床上(200rpm)孵育2h。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。(11)移走上清，加入300μlPBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。在室温下放在摇床(200rpm)上孵育30min。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。(12)移走上清，加入1mlPBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。(13)重复步骤12一次，用PBS-TBN洗涤2次。(14)加入500μlPBS-TBN，重悬偶联好和洗涤好的微球。(15)用细胞计数器计数微球的数量，换算出每种微球的浓度。(16)把偶联好的微球放在4℃避光保存，一般每种探针偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。实施例2：本专利技术所述鲍曼不动杆菌多重耐药基因核酸检测液相芯片在临床检测中的应用利用本专利技术所述鲍曼不动杆菌多重耐药基因检测液相芯片检测鲍曼不动杆菌多重耐药基因的方法步骤：1.PCR扩增：共提取40份鲍曼不动杆菌核酸，其中30份为已知耐药基因的阳性标本，5份为阴性对照，5份为不含耐药基因的标本。根据实验要求，另设一份空白对照。分别取40份鲍曼不动杆菌培养液，提取DNA。利用上述的引物配制多重PCR反应体系(40ul)：配制的反应体系按下述程序扩增：a)第一阶段：95℃，10min，1个循环。b)第二阶段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40个循环。c)第三阶段：72℃，10分钟,1个循环。2.液相芯片检测(1)分别取出上述制备的针对8种耐药基因的偶联微球各500个，按等比例混合，分装在96孔板中，每一个孔中含有各种特异性探针的偶联微球各500个，加入待检PCR产物2μl；(2)52℃杂交30min；(3)加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)100μl，混匀，52℃孵育30min；(4)加入100μlPBS-TBN重悬微球，用于液相芯片进行检测；(5)液相芯片检测中，红色荧光定义微球的种类，确定待测样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片，包括对应鲍曼不动杆菌不同耐药基因的微球、探针、特异性引物、生物素结合的引物及链霉亲和素‑藻红蛋白，其特征在于：鲍曼不动杆菌8种耐药基因分别是OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA；所述微球是分别与针对上述8种耐药基因的特异性探针偶联的8种微球；所述探针是针对上述8种耐药基因的氨基化的特异性探针；所述特异性引物能对上述8种耐药基因进行特异性扩增；其探针序列为

【技术特征摘要】
1.一种多重耐药鲍曼不动杆菌核酸检测液相芯片，包括对应鲍曼不动杆菌不同耐药基因的微球、探针、特异性引物、生物素结合的引物及链霉亲和素-藻红蛋白，其特征在于：鲍曼不动杆菌8种耐药基因分别是OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA；所述微球是分别与针对上述8种耐药基因的特异性探针偶联的8种微球；所述探针是针对上述8种耐药基因的氨基化的特异性探针；所述特异性引物能对上述8种耐药基因进行特异性扩增；其探针序列为耐药基因探针序列OXA23OX-PF:NH2-TTTTTTTTTAACGTTGGAACATTGGAACTEMTE-PR:NH2-TTTTTTTTTCGTAATTGCGGTAAGAIMPIM-PF1:NH2-TTTTTTCAAGATAATCGGAAGGAVIMVI-PF:NH2-TTTTTTTTAGGCAATGGTCTGCGAAMPCAM-PF1:NH2-TTTTTTTAGATACAGGCAATCTAAC3AAC3-PF3:NH2-TTTTTTAGCGCCAAGCGTTTAAGAAC6’AAC6’-P...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宁，宫维平，柳晓，
申请(专利权)人：山东立菲生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37