一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法和引物技术

本发明专利技术公开了一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法与引物，一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，包括扩增RPGR基因ORF15外显子的正、反向引物，一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法，包括如下步骤：(1)提取样本DNA；(2)利用一对扩增引物RPGR_ORF15_F3和RPGR_ORF15_R6对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；(3)至少利用一种测序引物对扩增产物进行测序，获得所述的扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与RPGR基因野生型参考序列RPGR‑ref进行比较，来确定突变位点是否存在。本发明专利技术的引物具有特异性强、灵敏度高的优点，本发明专利技术的检测方法不仅能够准确检测单核苷酸突变，也能有效检测到纯合或杂合的移码变异。

A method and primer for detection of mutations in the exon of the RPGR gene ORF15

The invention discloses a method for detecting RPGR gene ORF15 mutation and exon primer method, a detection of RPGR gene mutation of the exon of ORF15 primers, including the forward and reverse primers to amplify RPGR gene exon ORF15, a detection of RPGR gene mutations of the ORF15 explicit method, which comprises the following steps: (1) samples from DNA; (2) using a pair of primers of RPGR_ORF15_F3 and RPGR_ORF15_R6 (1) in DNA were amplified, amplified products; (3) a sequencing primer by sequencing the PCR product amplified products obtained at least, the gene sequence; (4) to (3) the gene sequence and RPGR gene of wild type RPGR reference sequence in ref for comparison, to determine whether there is mutation. The primers of the invention have the advantages of strong specificity and high sensitivity. The detection method of the invention can detect not only single nucleotide mutation, but also homozygous or heterozygous frameshift.

【技术实现步骤摘要】
一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法和引物
本专利技术涉及属于生物检测
，尤其涉及一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法与引物。
技术介绍
视网膜色素变性(RP)是一组最常见的视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野缺损的遗传性、致盲性眼底病。男性XLRP患者的临床表型比常染色体显性和隐性RP患者的临床表型都要严重，并且XLRP患者的比率为总RP患者的10-20％。与XLRP相关的基因中，又以RPGR基因突变引起的症状最为严重，超过70％的XLRP是由于RPGR基因突变引起。RPGR基因上的外显子ORF15是XLRP的一个突变热点区，大约55％的XLRP是由ORF15突变引起。然而，由于外显子ORF15上存在大片段的嘌呤核苷酸重复序列，使得准确检测ORF15的序列变得很困难。目前，利用基于二代测序的基因检测panel或者全外显子测序(WES)技术检测ORF15序列，其测序结果准确度普遍较低。另一方面，采用一代测序技术检测ORF15序列则需要特定试剂、特定PCR反应条件以及多对重叠引物，而且测序结果也通常出现杂峰。因此，克服ORF15序列检测的困难对于视网膜疾病患者外显子ORF15序列的高效检测、分析的完整性和准确性十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有产品中的不足，提供一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物与方法。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，包括扩增RPGR基因ORF15外显子的正、反向引物；其碱基序列为：RPGR_ORF15_F3：5'-GACTAAACCCATAATATCCAAATCCA-3'RPGR_ORF15_R6：5'-GCCAAAATTTACCAGTGCCTCCTAT-3'。引物还包括7种测序引物，其碱基序列为：ORF15_CR：5'-CACGTAATGAGTGCCCGTTAT-3'ORF15_R5：5'-ACTGGCCATAATCGGGTCACAT-3'RPGR_ORF15-R9：5'-CCCTGTGTGTTAGTAACTGAC-3'ORF15_R8C：5'-CTTCTTCGCCTGTCTCCTGATA-3'RPGR_ORF15-R8b：5'-TCCTTCCTCCTCTTCCCCCTCCCA-3'RPGR_ORF15-R7b：5'-CCTTCCTCCTCTTCCCCCTCA-3'ORF15_R4：5'-CTCTCCTTCCTCCTTTTCAC-3'。正、反向引物的使用浓度比为RPGR_ORF15_F3：RPGR_ORF15_R6＝1:1。一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法，包括如下步骤：(1)提取样本DNA；(2)利用一对扩增引物RPGR_ORF15_F3和RPGR_ORF15_R6对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；(3)至少利用一种测序引物对扩增产物进行测序，获得所述的扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与RPGR基因野生型参考序列RPGR-ref进行比较，来确定突变位点是否存在。所述步骤(2)中的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性15min；第二阶段，变性温度95℃，45sec，退火温度60℃，1min，延伸温度72℃，3.5min，循环40次；第三阶段，延伸72℃，5min；第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，该引物具有特异性强、灵敏度高的优点，同时提高了检测RPGR基因ORF15外显子突变的效率。此外，本专利技术还提供了一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的方法，通过使用该方法不仅能够准确检测单核苷酸突变，也能有效检测到纯合或杂合的移码变异，极大地增强了对视网膜疾病患者RPGR基因ORF15外显子序列检测和分析的完整性和准确性，对于临床上视网膜疾病患者的治疗具有重要的指导意义。附图说明图1本专利技术提供的RPGR基因ORF15外显子的扩增片段。图2PCR扩增产物的凝胶电泳图。图3测序引物ORF15_CR的部分测序图。图4测序引物ORF15_R5的部分测序图。图5测序引物RPGR_ORF15-R9的部分测序图。图6测序引物ORF15_R8C的部分测序图。图7测序引物RPGR_ORF15-R8b的部分测序图。图8测序引物RPGR_ORF15-R7b的部分测序图。图9测序引物ORF15_R4的部分测序图。图10临床样本的RPGR基因ORF15外显子部分测序图。下面结合说明书附图对本专利技术的技术方案作进一步说明：实施例1：专利技术人针对RPGR基因ORF15外显子，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选了特异性好的引物，所述引物见表1。表1本专利技术提供扩增引物和测序引物序列及所在染色体上的位置将本专利技术将七种测序引物引物于UCSC中进行Blasting，RPGR基因ORF15外显子引物扩增片段位于chrX:38144608-38146560间，长度为1953bp。无其它同源基因，结果如图1所示，与RPGR基因参考序列相符。RPGR基因ORF15外显子突变的检测方法包括如下步骤(1)利用血液DNA提取试剂盒(百泰克，DP1801)，按照提取试剂盒说明书提取基因组DNA。提取基因组DNA简要操作如下：1)取200μl全血样品，加入20μl/管蛋白酶K溶液，混匀，室温15min，期间颠倒混匀几次。2)加入200μl结合液CB，立即剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10min。3)加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个进口吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，10,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱AC放入收集管中。5)向吸附柱AC中加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱AC放入收集管中。6)向吸附柱AC中加入700μl漂洗液WB(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱AC放入收集管中。7)向吸附柱AC中加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱AC放入收集管中。8)13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9)取出吸附柱AC，放入一个干净的1.7ml离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃中预热)，室温放置3-5min，12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA样本。10)将提取好的DNA用Nanodrop(ThermoFisher，ND2000)，进行浓度测定并标记浓度值。若DNA当天不使用，则要保存在-20℃。(2)利用扩增引物RPGR_ORF15_F3和RPGR_ORF15_R6对(1)中的DNA进行扩增，获得PCR扩增产物。PCR扩增采用QTaq热启动酶(QIAGEN，Y5-203203)，利用扩增引物RPGR_ORF15_F3和RPGR_ORF15_R6对(1)中的DNA进行扩增的简要操作如下：1]、将PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，其特征在于，包括扩增RPGR基因ORF15外显子的正、反向引物；其碱基序列为：RPGR_ORF15_F3：5'‑GACTAAACCCATAATATCCAAATCCA‑3'RPGR_ORF15_R6：5'‑GCCAAAATTTACCAGTGCCTCCTAT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，其特征在于，包括扩增RPGR基因ORF15外显子的正、反向引物；其碱基序列为：RPGR_ORF15_F3：5'-GACTAAACCCATAATATCCAAATCCA-3'RPGR_ORF15_R6：5'-GCCAAAATTTACCAGTGCCTCCTAT-3'。2.根据权利要求1所述一种检测RPGR基因ORF15外显子突变的引物，其特征在于，所述引物还包括7种测序引物，其碱基序列为：ORF15_CR：5'-CACGTAATGAGTGCCCGTTAT-3'ORF15_R5：5'-ACTGGCCATAATCGGGTCACAT-3'RPGR_ORF15-R9：5'-CCCTGTGTGTTAGTAACTGAC-3'ORF15_R8C：5'-CTTCTTCGCCTGTCTCCTGATA-3'RPGR_ORF15-R8b：5'-TCCTTCCTCCTCTTCCCCCTCCCA-3'RPGR_ORF15-R7b：5'-CCTTCCTCCTCTTCCCCCTCA-3'ORF15_R4：5'-CTCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伦钧，杨金龙，王云霞，沈君霞，
申请(专利权)人：杭州科宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33