CDCA5在胃癌中的表达载体及其构建方法及CDCA5在胃癌中特异干扰片段技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及CDCA5在胃癌中的表达载体及其构建方法及CDCA5在胃癌中特异干扰片段。本发明专利技术的CDCA5在胃癌中的表达载体为pEGFP‑N1‑3FLAG/

Expression vector of CDCA5 in gastric cancer and its construction method and specific interference fragment of CDCA5 in gastric cancer

The present invention relates to the field of gene engineering technology, in particular to the expression vector of CDCA5 in gastric cancer and its construction method, and the specific interference fragment of CDCA5 in gastric cancer. The expression vector of CDCA5 gene in gastric cancer pEGFP N1 3FLAG/

【技术实现步骤摘要】
CDCA5在胃癌中的表达载体及其构建方法及CDCA5在胃癌中特异干扰片段
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及CDCA5在胃癌中的表达载体及其构建方法及CDCA5在胃癌中特异干扰片段。
技术介绍
细胞分裂周期相关蛋白5(celldivisioncycleassociated5，CDCA5)基因定位于人染色体11q13.1，其主要功能是确保姐妹染色单体在有丝分裂后期准确分离。近年来，有研究发现CDCA5在多种肿瘤中高表达，如肺癌，口腔鳞状细胞癌（OSCC），尿路上皮，并且与患者预后不良相关。目前为止，尚未见报道CDCA5在胃癌中的表达以及细胞功能实验研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术的不足，提供CDCA5在胃癌中的表达载体。本专利技术的目的之二在于针对现有技术的不足，提供CDCA5在胃癌中的表达载体的构建方法。本专利技术的目的之三在于针对现有技术的不足，提供CDCA5在胃癌中特异干扰片段。为了实现上述目的之一，本专利技术采用如下技术方案：提供CDCA5在胃癌中的表达载体，所述表达载体为pEGFP-N1-3FLAG/CDCA5。为了实现上述目的之二，本专利技术采用如下技术方案：提供CDCA5在胃癌中的表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤一，设计两个引物序列CDCA5(18851-3)-P1和CDCA5(18851-3)-P2，其中，CDCA5(18851-3)-P1的序列为TACCGGACTCAGATCTCGAGATGTCTGGGAGGCGAACGCG，CDCA5(18851-3)-P2的序列为GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTTTCAACCAGGAGATCAAACTGCTC；步骤二，设计插入的目的序列，所插入的目的序列具有SEQIDNO:1所示的序列；步骤三，将CDCA5(NM_080668)的序列利用步骤一的两个引物序列插入步骤二的目的序列，得到重组载体pEGFP-N1-3FLAG/CDCA5，即为所述的CDCA5在胃癌中的表达载体。为了实现上述目的之三，本专利技术采用如下技术方案：提供CDCA5在胃癌中特异干扰片段，是上述所述的CDCA5在胃癌中的特异干扰片段，包括如下所示四个干扰片段：#1SenseSeq:CGGAAAGUUUCCUCGCGUATTAntiSeq:UACGCGAGGAAACUUUCCGTT#2SenseSeq:GGAACUAAAUUUAAGGAAATTAntiSeq:UUUCCUUAAAUUUAGUUCCTT#3SenseSeq:GAAAGCCCAUCGUCUUAAATTAntiSeq:UUUAAGACGAUGGGCUUUCTT#4SenseSeq:CCGAGAAACAGAAACGUAATTAntiSeq:UUACGUUUCUGUUUCUCGGTT。本专利技术与现有技术相比较，有益效果在于：（1）本专利技术的CDCA5在胃癌中的表达载体，是首次提出的CDCA5在胃癌中的表达，并研究了其对MGC-803细胞的功能的影响，对于日后的深入研究具有很好的借鉴作用。（2）本专利技术的CDCA5在胃癌中的表达载体的构建方法，该构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。（3）本专利技术提供CDCA5在胃癌中特异干扰片段，具并研究了该干扰片段对MGC-803细胞增殖、迁移和周期的影响，对于日后的深入研究具有很好的借鉴作用。附图说明图1是本专利技术的CDCA5在胃癌中的表达载体的结构示意图。图2是验证实验中表达载体对MGC-803细胞功能的影响显示图。其中，A．RT-qPCR检测过表达CDCA5的mRNA改变，过表达组的mRNA明显比对照组高；B，westernblot检测过表达CDCA5后蛋白的改变；C.CCK-8检测过表达CDCA5对细胞增殖的影响：过表达组细胞的生长速度比对照组快；D.平板克隆形成实验：过表达组的克隆数明显高于对照组；E.Transwell细胞迁移实验检测过表达CDCA5对细胞迁移的影响：过表达组细胞的迁移率明显高于对照组。*：P<0.05;**:P<0.001。图3是验证实验中干扰片段对细胞增殖、迁移和周期的影响显示图。其中，A:RT-qPCR检测4段CDCA5干扰片段干扰MGC-803细胞中CDCA5的mRNA的表达，四个干扰组CDCA5的表达明显下降，P<0.05;C:用CDCA5干扰片段1和干扰片段2分别干扰CDCA5后对MGC-803细胞增殖的影响，CCK-8结果显示，干扰CDCA5抑制细胞增殖(P<0.05)；D:干扰组的平板克隆数明显小于对照组(P<0.05)；E:干扰组的细胞迁移率明显下降（P<0.05）F、干扰片段1、干扰片段2和对照组的周期分析结果：处于G1期和S期细胞数明显下降，G2/M期细胞数明显升高，细胞阻滞在G2/M期（P<0.05）。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1。本实施例的CDCA5在胃癌中的表达载体，如图1所示，所述表达载体为pEGFP-N1-3FLAG/CDCA5。实施例2。实施例1的CDCA5在胃癌中的表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤一，设计两个引物序列CDCA5(18851-3)-P1和CDCA5(18851-3)-P2，其中，CDCA5(18851-3)-P1的序列为TACCGGACTCAGATCTCGAGATGTCTGGGAGGCGAACGCG，CDCA5(18851-3)-P2的序列为GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTTTCAACCAGGAGATCAAACTGCTC；步骤二，设计插入的目的序列，所插入的目的序列具有SEQIDNO:1所示的序列；步骤三，将CDCA5(NM_080668)的序列利用步骤一的两个引物序列插入步骤二的目的序列，得到重组载体pEGFP-N1-3FLAG/CDCA5，即为所述的CDCA5在胃癌中的表达载体。实施例3。实施例1的CDCA5在胃癌中特异干扰片段，包括如下所示四个干扰片段：#1SenseSeq:CGGAAAGUUUCCUCGCGUATTAntiSeq:UACGCGAGGAAACUUUCCGTT#2SenseSeq:GGAACUAAAUUUAAGGAAATTAntiSeq:UUUCCUUAAAUUUAGUUCCTT#3SenseSeq:GAAAGCCCAUCGUCUUAAATTAntiSeq:UUUAAGACGAUGGGCUUUCTT#4SenseSeq:CCGAGAAACAGAAACGUAATTAntiSeq:UUACGUUUCUGUUUCUCGGTT。验证实验：一、CDCA5过表达载体验证：摇菌后提取质粒，细胞铺板后进行转染，转染24h后提取RNA，48h后提蛋白，分别用RT-qPCR，WB验证过表达是否成功。RT-qPCR实验结果显示，过表达CDCA5组的mRNA明显升高（P<0.001，图2A）。WB结果显示，过表达CDCA5后CDCA5蛋白水平明显升高（图2B），表明CDCA5过表达载体构建成功。本文档来自技高网...

【技术保护点】
CDCA5在胃癌中的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pEGFP‑N1‑3FLAG/

【技术特征摘要】
1.CDCA5在胃癌中的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pEGFP-N1-3FLAG/CDCA5。2.权利要求1所述的CDCA5在胃癌中的表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一，设计两个引物序列CDCA5(18851-3)-P1和CDCA5(18851-3)-P2，其中，CDCA5(18851-3)-P1的序列为TACCGGACTCAGATCTCGAGATGTCTGGGAGGCGAACGCG，CDCA5(18851-3)-P2的序列为GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTTTCAACCAGGAGATCAAACTGCTC；步骤二，设计插入的目的序列，所插入的目的序列具有SEQIDNO:1所示的序列；步骤三，将CDCA5(NM_080668)的序列利用步骤一的两个引物序列插入步骤二的目的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志刚，陈浩勤，张贺，杜进林，欧阳平，吴莉莉，陈婷婷，林博德，何荣威，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44