一种重组灵芝免疫调节蛋白制备方法技术

本发明专利技术提供一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法。该方法按以下步骤：构建工程菌，设计编码ＬＺ－８蛋白基因，将其与酿酒酵母α－因子前导肽编码序列相连成为融合基因，将此基因转入毕赤酵母表达系统ＧＳ１１５进行重组表达，获得高效表达ｒＬＺ－８蛋白菌株；１００Ｌ发酵罐规模下的发酵，使用改良种子培养基和发酵培养基，调整甘油、甲醇加入量，发酵后期补加０．５Ｍ（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］；经离心分离，上柱纯化，超滤出盐，冷冻干燥制成干粉。该方法发酵规模大，工艺条件优化，产率高。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法，按以下步骤进行：　　　　（１）构建工程菌：　　　　设计编码ＬＺ－８蛋白基因，将其与酿酒酵母α－因子前导肽编码序列相连成为融合基因，将此基因转入毕赤酵母表达系统ＧＳ１１５进行重组表达，获得高效表达ｒＬＺ－８蛋白菌株；　　　　（２）１００Ｌ发酵罐规模下的发酵：　　　　制种：将冻存菌液涂布于含Ｇ４１８抗性２０００μｇ.ｍｌ↑［－１］的ＹＰＤ平板，激活菌种，挑取一个单克隆放入装有１０ｍｌ改良ＢＭＧＹ种子培养基的５０毫升离心管中，置于恒温摇床２５０ｒｐｍ.ｍｉｎ↑［－１］，２８℃培养１８小时；将１０ｍｌ菌液平分入两个装有１Ｌ改良的ＢＭＧＹ培养基的１０Ｌ三角烧瓶，置于恒温摇床２５０ｒｐｍ.ｍｉｎ↑［－１］，２８℃培养１８ｈｒ。将菌液稀释十倍测吸光值ＯＤ↓［６００ｎｍ］＝１．０１２，可以用于接种；上罐：将配方为Ｈ↓［３］ＰＯ↓［４］８５％　　２１ｍｌ，ＣａＳＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ　　６ｇ，Ｋ↓［２］ＳＯ↓［４］９６ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ　　７８ｇ，ＫＯＨ　　２６ｇ，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　　２Ｌ，Ｐｅｐｔｏｎｅ　　２０ｇ的发酵培养基，加入去离子水至４０Ｌ，经在罐灭菌，冷却后，通过加入氨水，将培养基的ｐＨ值调至５．０，接入种液２Ｌ；发酵过程中补加生物素Ｂｉｏｔｉｎ，ＰＴＭ１微量元素盐；发酵温度２８－３０℃，转速５００－８００ｒｐｍ，通气量０．１－１．０ｖｖｍ；接种后恒化培养约２０ｈ左右，每隔６ｈ取样测菌体湿重和发酵液ＯＤ↓［６００］值，待菌体湿重增至１２０ｇ／Ｌ左右时，以１２０ｍｌ／ｈ补入配制好的５０％甘油，菌体湿重增至１８０ｇ／Ｌ左右时停止，饥饿胁迫３０ｍｉｎ。设定初始补料速度为８０ｍｌ／ｈ，每２ｈ增加５０％，至８ｈ结束，并以此流速恒定补料８ｈ后，将流速提至４００ｍｌ／Ｌ，保持此流速３０ｈ左右，在１０ｈ之内将流速降至８０ｍｌ／Ｌ，保持此流速４０ｈ；补加甲醇，自发酵开始每隔一定时间调整甲醇加入量，０－２ｍｌ／ｈ／Ｌ（０－２ｈ）、２－５ｍｌ／ｈ／Ｌ（３－８ｈ）、５－１０ｍｌ／ｈ／Ｌ（９－１６ｈ）、１０ｍｌ／ｈ／Ｌ（１７－４７ｈ）、１０－２ｍｌ／ｈ／Ｌ（４８－５８ｈ）、２ｍｌ／ｈ／Ｌ（５９－１０３ｈ）；发酵进入４８－５８ｈ根据菌体湿重大于或小于３５０ｇ／Ｌ减小或加大甲醇补入流量；在发酵后期即诱导开始７０ｈ后，以１ｍｌ／ｈ／Ｌ速率补加０．５Ｍ的（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］１０ｈ；...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙非，刘立侠，许守民，梁重阳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]