本发明专利技术公开了一种抑制ｃｏｒｅｌ β１－３半乳糖基转移酶载体的ｓｈＲＮＡ真核表达载体的构建方法及应用，其步骤是根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ提供的Ｃｏｒｅｌ ｂｅｔａ１，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ的基因序列，选取一段２１ｎｔ的核苷酸序列作为靶序列，设计并合成引物，通过引物退火，连接至载体ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６，得到真核表达载体ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ，将ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ经肌肉注射至Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，能显著降低小鼠Ｔ细胞活性，抑制小鼠免疫功能，该质粒在制备治疗或预防移植排斥反应、抑制Ｔ细胞活性的药物中应用前景广泛。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种抑制ｃｏｒｅ１β１－３半乳糖基转移酶的ｓｈＲＮＡ载体的构建方法，其特征是它包括下列步骤：Ａ．靶序列的选择及引物的合成：根据ＧｅｎｅＢａｎｋ提供的Ｃｏｒｅ１ｂｅｔａ１，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ基因序列，选取一段２１ｎｔ的核苷酸序列作为靶序列，并设计并合成引物，引物为：Ｏｌｉｇｏ１．５’ＧＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＣＣＣＴＡＴＧＴＴＴＣＡ３’；Ｏｌｉｇｏ２．５’ＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＧＧＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣ３’；Ｏｌｉｇｏ３．５’ＡＧＣＴＴＡＣＡＴＡＧＧＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴ３’；Ｏｌｉｇｏ４．５’ＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＣＣＣＴＡＴＧＴＡ３’。Ｂ．ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ的构建及鉴定将Ｏｌｉｇｏ１和Ｏｌｉｇｏ２稀释至１０ｐｍｏｌ.ｍｌ－１，各取２μｌ混合，加水稀释至２０μｌ，９５℃５ｍｉｎ，５５℃１０ｍｉｎ，然后冷却至室温，Ｏｌｉｇｏ１和Ｏｌｉｇｏ２退火形成双链，再与经ＡｐａⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切回收后的质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０－Ｕ６连接，转化至感受态ＤＨ５α，挑取单个菌落，经ＡｐａⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定，克隆标记为ｐＵ６－ｇａｌｔ１２。ｐＵ６－ｇａｌｔ１２经ＡｐａⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，回收后与Ｏｌｉｇｏ３和Ｏｌｉｇｏ４的退火产物连接，转化至感受态ＤＨ５α，挑取单个菌落，经ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定，克隆经测序鉴定，得到重组质粒ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ；Ｃ．特异性ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ转染ＣＴ－２６细胞提取ｐｕ６－ｓｈＲＮＡｅ质粒，测定ＤＮＡ浓度，将４μｇＤＮＡ加入２５０μｌ无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基中，另取２４０μｌ无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基，其中加入１０μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００脂质体，５分钟内混合含ＤＮＡ和脂质体的上述培养基，３０分钟后将上述混合物加入ＣＴ－２６细胞中；Ｄ．ＲＴ－ＰＣＲ检测目的基因的表达：转染４８ｈ后收获上述转染的细胞，提取细胞的总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ，内参Ｇ３ＤＰＨ上游引物为：５′ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ３′，下游引物为：５′ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ３′，ｃｏｒｅｌβ１－３半乳糖基转移酶基因上游引物：５′ＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡ３′，下游引物：５′ＧＧＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴ３′，ＰＣＲ反应体系为：１０×ＴａｑＤＮＡ聚合酶缓冲液５μｌ２５ｍＭ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，周霞，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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