克隆的犬科动物及其生产方法技术

本文公开了克隆的犬科动物及其生产方法。所述克隆的犬科动物的生产方法包括将犬科动物的卵母细胞的细胞核去除掉以制备去核的受体卵母细胞，在优化条件下采用犬科动物的体细胞作为核供体细胞，将核移植到去核的卵母细胞中以制备核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中。本发明专利技术提供了生产克隆的犬科动物的方法。因此本发明专利技术有助于兽医学、人类学和医学方面研究的发展，如优良犬科动物的繁殖、稀有或濒危犬科动物的保护、异种移植和疾病动物模型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。更具体地说，本专利技术涉及生 产克隆的犬科动物的方法和用该方法生产的克隆的犬科动物，所述生产克隆 的犬科动物的方法包括将犬科动物的成熟的卵母细胞的细胞核去除掉以制 备去核的受体卵母细胞，在优化的条件下采用犬科动物的体细胞作为核供体 细胞将核移植到去核的卵母细胞中以制备核移植胚胎，然后将该核移植胚胎 移植到代孕母体的输卵管中。
技术介绍
随着最新的通过细胞融合或胞质内细胞注射进行体细胞移植技术的发 展，已经可以制备克隆的动物了。体细胞核移植技术是使将要出生的活体后代不经历在生殖过程中通常 存在的减数分裂及形成单倍体生殖细胞的方法，该方法通过将成年动物的二 倍体体细胞移植到去核的细胞中形成胚胎并在体内移植该胚胎形成新的个 体。 一般地，在体细胞核移植技术中，在体外人工培养到减速分裂的中期II 以后，使用待移植的受体卵母细胞和体细胞供体细胞核。然后，为了防止因 体细胞核移植导致的染色体变异，在移植体细胞前，必须除去成熟的卵母细 胞的细胞核。在将体细胞注射到成熟的卵母细胞的卵周隙或细胞质中后，用 电刺激使去核的卵细胞和体细胞相互融合。用电剌激或化学物质激活融合 体，并将该融合体移植到代孕母体中以生产活体后代。在本领域可以广泛地采用这种体细胞核移植技术，例如，优良动物的繁 殖，稀有动物或濒危动物的保护、某种营养素的生产、治疗用的生物材料的 生产、用于器官移植的动物的生产、具有某种疾病或症状的动物的生产、用作替代如细胞和基因的治疗在内的器官移植的具有药用价值的动物的生产。动物克隆技术首先由英国Roslin Institute的Wilmut博士实现的，Wilmut 博士通过取出六岁的绵羊的乳腺细胞并将该细胞移植到去核的卵母细胞中 以制备核移植胚胎，然后在体内移植该胚胎，从而得到克隆动物多莉(Dolly)。 自那以后，通过使用成年动物的体细胞进行核移植得到了克隆奶牛、克隆小 鼠、克隆山羊、克隆猪和克隆兔(WO 9937143A2， EP 930009A1, WO 9934669Al， WO9901164A1和US 5,945,577)。与此同时，不仅仅是工业动物如奶牛和猪，宠物如狗的克隆也引起了许 多人的兴趣。最近，在宠物中，猫首先被克隆出来，并且克隆狗的研究也在 进行。然而，还没有报道表明通过体细胞移植技术己经成功地克隆了犬科动
技术实现思路
因此，本专利技术的专利技术人进行了克隆犬科动物的生产方法的研究，结果， 本专利技术的专利技术人首先用体细胞移植方法在优化的电融合条件、核移植胚胎激 活条件和胚胎移植到代孕母体的条件下生产了克隆的犬科动物，从而完成了 本专利技术。因此，本专利技术的一个目的是提供一种采用体细胞核移植技术生产犬科动 物的核移植胚胎的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种采用所述方法制备的犬科动物的核移 植胚胎。本专利技术的另一个目的是提供一种生产克隆的犬科动物的方法，该方法包 括将所述核移植胚胎移植到代孕母体中以生产活体后代的步骤。本专利技术的另一个目的是提供一种采用所述方法生产的克隆的犬科动物。为了实现上述目的， 一方面，本专利技术提供了一种采用体细胞核移植技术 制备犬科动物的核移植胚胎的方法。另一方面，本专利技术提供一种采用所述方法制备的犬科动物的核移植胚胎。另一方面，本专利技术提供一种生产克隆的犬科动物的方法，该方法包括将 所述核移植胚胎移植到代孕母体中以生产活体后代的步骤。另一方面，本专利技术提供一种采用所述方法生产的克隆犬科动物。在下文中，将详细描述本专利技术。术语定义本文中使用的术语"核移植"是指通过人工地将一个去核的细胞和一 个具有核DNA的细胞合并，以获得具有相同特征形式和性质的基因操作技 术。本文中使用的术语"核移植胚胎"是指注入或融合有核供体细胞的胚胎。本文中使用的术语"克隆"是指制备具有与另一个体单位相同的基因 组的新个体单位的基因操作技术。在本专利技术中，该术语尤其是指一个细胞、 胚胎细胞、胎儿细胞、和/或动物细胞具有与另一个细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、和/或动物细胞基本相似或相同的核DNA序列的事实。本文中使用的术语"核供体细胞"是指被转移到受体卵母细胞的作为 核受体的细胞或细胞核。本文中使用的术语"受体卵母细胞"是指在去除核后接受核供体细胞 的细胞核移植的卵母细胞。本文中使用的术语"成熟卵母细胞"是指处于减速分裂中期II的卵母 细胞。本文中使用的术语"去核的卵母细胞"是指去除了细胞核的卵母细胞。本文中使用的术语"融合"是指核供体和受体卵母细胞的类脂膜的合 并。例如，类脂膜可以是细胞质膜或细胞核膜。可以在将核供体和受体卵母 细胞相互接近时或将核供体放置于受体卵母细胞的卵周隙空间时进行电刺 激融合。本文中使用的术语"激活"是指在核移植步骤之前、之中或之后刺激细 胞使细胞分裂。本文中使用的术语"活体后代"是指从子宫出来后存活的动物。"活体 后代"的动物可以是从母体出来后存活了至少一秒钟、 一分钟、 一天、 一周、 一个月、六个月或超过一年的动物。"活体后代"的动物可以不需要在子宫 环境的循环系统中生存。本文中使用的术语"犬科动物"包括狗、狼、狐(fox)、豺、丛林狼(coyotes)、韩国狼和狸(mccoon dogs)，优选包括狗或狼。众所周知狗是由 野生的狼驯养得到的，因此，狗和狼具有相同的染色体数并表现出相似的怀 孕周期及性激素的变化(Seal US等，Biology Reproduction 1979， 21:1057-1066)。本专利技术的特征是首次通过体细胞核移植技术成功地克隆了犬科动物，所 述体细胞核移植技术是在优化的电融合条件下制备犬科动物的核移植胚胎， 然后激活核移植胚胎并将核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中生产活体 后代。本专利技术制备犬科动物的核移植胚胎的方法包括以下步骤(a)将犬科动 物的成熟卵母细胞的细胞核去除掉，以制备去核的受体卵母细胞；(b)从供 体犬科动物的组织中分离体细胞，以制备核供体细胞；(c)将步骤(b)制 备的核供体细胞微注射到步骤(a)制备的去核的卵母细胞中，并在 3,0-3.5KV/cm的电压下对供体细胞和去核的卵母细胞进行电融合；(d)激活 步骤(c)制备的融合的卵母细胞。在下文中将详细描述本专利技术的犬科动物的核移植胚胎的制备方法的各 步骤。步骤l:受体卵母细胞的去核对于用作受体卵母细胞，从犬科动物收集的未成熟的卵母细胞可以在体 外成熟或收集在体内成熟的卵母细胞。 一般地，哺乳动物(如，牛、猪和绵 羊)的卵母细胞排出成熟的卵母细胞，即减速分裂中期II的卵母细胞，然而 与其它动物不同，犬科动物排出的卵母细胞处于减速分裂中期I并在输卵管中停留48-72小时的期间内成熟。由于犬科动物的卵母细胞核的成熟速度非 常慢并且犬科动物的排卵时间和生殖生理学与其它动物不同，因此，作为受 体卵母细胞使用的犬科动物的卵母细胞优选在体内成熟。更尤其是，从犬科动物收集成熟的卵母细胞优选在对犬科动物进行诱导 排卵后48-72小时，且更优选在72小时后进行。对于犬科动物排卵的具体 时间可以通过本领域已知的任何方法确定。对于确定犬科动物排卵的具体时 间的实例包括但不限于阴道涂片试验、血清性激素水平的检测和使用超声记 录诊断系统。动情期的开始可以通过外阴涨大和血浆血液的(serosanguionous)排放来确定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备犬科动物的核移植胚胎的方法，该方法包括以下步骤：（ａ）将犬科动物的成熟的卵母细胞的细胞核去除掉，以制备去核的受体卵母细胞；（ｂ）从供体犬科动物的组织中分离体细胞，以制备核供体细胞；（ｃ）将步骤（ｂ）制备的所述核供体细胞显微注射到步骤（ａ）制备的所述去核的卵母细胞中，并在３．０－３．５ＫＶ／ｃｍ的电压下对供体细胞和去核的卵母细胞进行电融合；和（ｄ）激活步骤（ｃ）制备的融合的卵母细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄禹锡，李柄千，姜成根，金敏奎，张龟，吴炫周，金惠珍，金正柱，SH穆罕默德，HF尤达，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力财团，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]