一种穿梭质粒及其衍生质粒制造技术

本发明专利技术公开了一种穿梭质粒及其衍生质粒。本发明专利技术所提供的穿梭质粒的核苷酸序列是序列表中的序列１；序列表中序列１的自５′末端第４８７２－５６６４位脱氧核糖核苷酸为卡那霉素抗性基因及其启动子。本发明专利技术还公开了该穿梭质粒的衍生质粒，它是将序列表中序列１的自５′末端第４８７２－５６６４位的卡那霉素抗性基因及其启动子进行倒位后，在其多克隆位点插入报告基因和谷氨酸棒杆菌ＬｅｕＢ基因的转录终止子得到的；所述报告基因的方向与所述卡那霉素抗性基因及其启动子方向相反；所述谷氨酸棒杆菌ＬｅｕＢ基因的转录终止子位于所述报告基因与所述卡那霉素抗性基因之间。这两种质粒的稳定性高，在基因工程上将得到广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种穿梭质粒及其衍生质粒。技术背景质粒是染色体外遗传因子，能够进行自主复制。它并不是寄主细胞生命活动必 需的遗传元件，但是能给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性，降解或利用某 些化合物等。在分子生物学研究中，质粒可以作为载体用于克隆外源基因。关于质 粒的研究已经相当深入，人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在 已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。在细菌基因工程领域，绝大部分质粒载体来自革兰氏阴性菌大肠杆菌，许多已经商品化。对革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌质粒的研究开始的较晚。1984年，先后报 告了谷氨酸棒杆菌质粒pBLl、 pCGl、 pCG2和pCG4等。(Santamaria. R. et al 1984 丄Gen. Microbiol. 130. 2237-2246.Ozaki. A et al 1984 Mol. Gen. Genet 196. 175-178 Kats咖ata. R. et al 1984 J. Bacteriol. 159.306-311)目前已经从各 种棒杆菌中分离出24种内源质粒。这24种内源质粒中大部分小质粒是隐蔽型的， 仅质粒pXZ10145是个例外，该质粒带有一个氯霉素抗性基因。(沈天翔等1993生 物工程学报9. 216-222)而在较大的质粒中，也只有pAGl、 pCG4和pTET3编码抗 生素抗性基因。根据谷氨酸棒杆菌可能的复制方式和复制起始蛋白之间的相似性， 可以把它们分为两组。 一组是采取滚环方式复制，包括pBLl族质粒和pCGl族质粒； 另一组采取e复制方式复制，包括pXZ10145族质粒和pCRY4族质粒。 一般来说， 采取e复制方式复制的质粒较采取滚环复制的质粒具有较高的稳定性。在谷氨酸棒 杆菌基因工程研究中，已构建的克隆载体大部分源于隐蔽型质粒pBLl (Miwa. K et al 1985 Gene 39. 281-286; Yeh. P et al 1986 Gene 47 301-306; Santamari. R. I. 1987 Gene 56 199-208; Patek. M. 1989 Appl. Microbiol. Biotechnol. 31. 65-69; Nesvera, J. et al 1990 Folia Microbiol. 35.273-277; Mukherjee. K. J. et al 1990. J. Biotechnol. 16. 109-122; Eikmanns. B. J. et al 1991 Gene 102. 93-98;Tauch. A. et al 1998a Arch. Microbiol. 169. 303-312; ); pCGl (Miwa. K. et al 1985 Gene 39.281—286; Yoshihama. M. et al 1985, J. Bacteriol.162. 591—597;); pCG2( Ozaki. A et al 1984. Mol. Gen. Genet 196. 175—178; Ikeda. M. and Kats咖ata. R. 1999. Appl. Environ. Microbial. 65.2497-2502;) 禾卩.pCG4 (Ikeda. M. and Katsumata. R. 1999. Appl. Environ. Microbial. 65.2497-2502;)。卡那霉素、博来霉素、氯霉素和红霉素的抗性基因的启动子均能 被棒杆菌的DNA聚合酶识别，已经被广泛地用于载体构建。另一方面，由于大肠杆 菌的基因操作系统已经比较成熟，目前在谷氨酸棒杆菌基因工程研究中使用的绝大 多数克隆载体都是在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间均能复制的穿梭载体，并且带有 多克隆位点。但目前鲜有从具有e复制机制的谷氨酸棒杆菌质粒出发构建克隆载体 的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种穿梭质粒及其衍生质粒。本专利技术所提供的一种穿梭质粒，名称为pAK6,它的核苷酸序列是序列表中的序 列1。pAK6是能够在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒载体。 其中，pAK6包括一个如下顺序排列的多克隆位点5"acl-fcoRI-勘7II-ffi/7rf111-尸WI-Z&I-SpM;所述多克隆位点的核苷酸序列是序列表中序列1自5' 末端第14-48位脱氧核糖核苷酸所示。除所述多克隆位点外，pAK6还包括一个氨 苄青霉素抗性基因及其启动子和一个卡那霉素抗性基因及其启动子；所述氨苄青霉 素抗性基因及其启动子的核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第2085-1227位 脱氧核糖核苷酸所示；所述卡那霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列是序列表中 序列1自5'末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸所示。本专利技术还提供了由pAK6衍生的穿梭质粒pAKC6，该穿梭质粒可作为启动子检测 载体。本专利技术所提供的pAKC6，是将pAK6的卡那霉素抗性基因及其启动子片段，即序 列表中序列1自5'末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸序列进行倒位后，在其多 克隆位点插入报告基因和谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子得到的；所述报告 基因的方向与所述卡那霉素抗性基因及其启动子方向相反；所述谷氨酸棒杆菌LeuB 基因的转录终止子位于所述报告基因与所述卡那霉素抗性基因之间。其中，所述报告基因可以是氯霉素乙酰转移酶基因；所述氯霉素乙酰转移酶基 因的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第50-827位脱氧核糖核苷酸所示。所述LeuB基因的转录终止子的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第6-37位脱 氧核糖核苷酸所示。质粒pAKC6的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2。本专利技术所述的质粒pAK6和pAKC6可在基因工程中应用。质粒稳定性实验结果表明，本专利技术构建的质粒pAK6和pAKC6在没有选择压力 的情况下，连续培养100代，质粒pAK6保持率为100%，质粒pAKC6保持率为98. 5% 以上，与滚环复制型质粒pUL340的保持率(28%以下)相比明显高于滚环复制型质 粒；质粒复制中间体的电镜检测实验表明质粒pAK6和pAKC6以8型复制；质粒稳 定性实验和质粒复制中间体的电镜检测实验结果综合表明质粒pAK6和pAKC6的稳 定性高，在基因工程上将得到广泛的应用。 附图说明图l为质粒pAK6的物理图谱。图2为质粒pAKC6的物理图谱。图3为质粒pAK6的构建图。图4为质粒pAK6的酶切电泳分析M: DNAmarker、入/￡c。RT 141、 1: v5b。R I 、 2:拳I 、 3:份211、 4:历72dl11、 5:尸Wl 、 6:H 、 7:&力I 。图5为PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因基因M: DNA marker为A/EcoT14I、 1: PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因产物。 图6为PCR扩增卡那霉素抗性基因M: DNA marker为A/EcoT14I、 1: PCR扩增卡那霉素抗性基因产物。图7为质粒pAKC6的构建图。图8为质粒pAKB6和pAKC6的酶切电泳分析结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种穿梭质粒，它的核苷酸序列是序列表中序列１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁久元，李开，刘桂明，赵智，王宇，张英姿，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]