本发明专利技术公开了一种食蟹猴Ｐ４５０ ２Ｂ６药物代谢酶及其与食蟹猴Ｐ４５０氧化还原酶的共表达重组载体。食蟹猴Ｐ４５０ ２Ｂ６药物代谢酶能催化盐酸丁氨苯丙酮的羟基化与３－甲基苯乙妥因的Ｎ端脱甲基，其基因序列或其互补序列是与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的突变率为０－１％的序列。食蟹猴Ｐ４５０ ２Ｂ６药物代谢酶与食蟹猴Ｐ４５０氧化还原酶的共表达重组载体包含食蟹猴的Ｐ４５０ ２Ｂ６药物代谢酶序列的开放阅读框和食蟹猴的Ｐ４５０氧化还原酶序列的开放阅读框。食蟹猴的Ｐ４５０氧化还原酶的序列或其互补序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２。本发明专利技术异源表达的蛋白仅代表食蟹猴Ｐ４５０ ２Ｂ６亚型，其系统更接近于食蟹猴体内代谢的真实情况。
【技术实现步骤摘要】
食蟹猴P450 2B6药物代谢酶及其与食蟹猴P450氧化还原酶的共表达重组载体 駄领域本专利技术涉及基因工程研究领域，具体涉及一种食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Mamm /osdcw/a^) P450 2B6药物代谢酶(Cytochrome P450 2B6)及其与食蟹猴P450氧化还原酶 (NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)的共表达重组载体。
技术介绍
细胞色素P450是重要的药物代谢I相酶，市场上8TO以上的药物是通过细胞色素P450代谢的。 2B亚家族是细胞色素P450基因家庭的主要成员，主要包括2B6等。细胞色素P450 2B6能够代谢 多种药物如盐酸丁氨苯丙酮(Bupropion),3-甲基苯乙妥因((s)-(+)-Mephenytoin)。目前，包括人，狗， 大鼠，小鼠等多种动物的细胞色素P450基因序列已经被克隆，各种细胞色素P450也已经在大肠 杆菌，酵母，哺乳动物细胞等宿主中表达。异源表达的细胞色素P450是研究药物代谢，进行体外 药物筛选的重要手段。食蟹猴是常用的临床前安全性评价实验大动物，其与人的亲缘关系非常接 近，因而在代谢上表现出较高的相似性。到目前为止，仍未见食蟹猴与人P450 2B6亚型相应的基 因的克隆的报道。因此，克隆錢猴P450 2B6基因并进行异源^ii^于体外药物筛选有重要意义。P450酶在催化反应中需要两个电子和两个质子，其中的电子由内质网上的NADPH(还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原型辅酶n)-细胞色素P450氧化还原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)提供。在体外反应中，缺少NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的系统不具有催化 活性。到目前为止，将維猴P450 2B6与食蟹猴P450氧化还原麟因共表达还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于,一种食蟹猴的P450 2B6药物代谢酶及其与食蟹猴P450氧,原酶的 共表达重组载体。克隆，猴P450 2B6(cyp2B6)基因并在昆虫细胞中进行异源表达；还包括克隆 食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因，构建包含NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的，猴P450 2B6(C7p2B6)的昆虫表达载体，并将此载体用于大翻格食蟹猴P450 2B6的代谢物。 本专利技术通过以下方式达到该目的本专利技术的食蟹猴(Cynomolgus Monkey, M"rao /osdcw/o^y)的P450 2B6药物代谢酶 (Cytochrome P4502B6)，能催化盐酸丁氨苯丙酮(Bupropion)的羟Sifc (Hydroxy)与3-甲基苯 乙妥因((s)-(+)-Mephenytoin)的N端脱甲基(Demethylation)。根据已经发表的人P450基因序列(Genebank, Accession NO. : NM—000767)，以逆转录自食 蟹tt RNA的cDNA为模板，ilil聚合,式反应(PCR)扩增食蟹猴P450 2B6的编码区序列(c^ 2B6)，扩增得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoP2B6质粒。其中，设计的引物不包 含除起始密码(ATG)外的食蟹猴P450 2B6的编码区序列(c^2B6)。经测序，得到的编码区序列 全长1482碱基对，编码494个氨基酸，即P450 2B6药物代谢酶的基因序列或其互补序列是与SEQ ID NO: 1的突变率为0-1%的序列。本专利技术的食蟹猴的P450 2B6药物代谢酶与P450氧化还原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)的共表达重组载体包含上述食蟹猴的P450 2B6药物代谢酶序列的开放阅读框和 P450氧化还原酶序列的开放阅读框。以上述克隆的食蟹猴P450 2B6的基因(c^ 2B6)为模板，以 包含RsrII及HindIII限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴P450 2B6的编码区序列(cy/ 2B6)并 定向插入昆虫,载体pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位点之间，得到pFB-cynoP2B6表 达载体。按照Bac-to-Bac中表达，猴P450 2B6蛋白。异源表达的食蟹猴P450 2B6蛋白可以用 作体外筛选，测试药物的代谢性质。根据已经发表的人NADPH-细胞色素P450氧化还原HS因序列(Genebank， Accession N0.: NM_000941)，以逆转录自食蟹^ffRNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)从扩增， 猴P450氧化还原酶基因的编码区序列。其中，设计的引物不包含除起始密码(ATG)外的 猴 P450 2B6的编码区序列。经测序，得到的编码区序列全长2034个MS对，编码677个氨基酸。 即所述P450氧化还原酶的序列或其互补序列如SEQ ID NO: 2。以上述克隆的維猴NADPH-细胞 色素P450氧化还原SIS因为模板，以包含BbsI及NsiI限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的编码区序列并定向插入昆虫表达载体pFastBac-Dual的Bbsl及Nsil酶切位点之间，得到pFB-cynoPOR表达载体。按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Instruction Manual (由invitrogen公司提供)操作，在sf-9昆虫细胞中表达食蟹猴NADPH-P450 氧化还原酶。异源表达的食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶可以用作体外筛选，测试药物的代谢性质。 所述的重组载体还含有杆状病毒基因，能感染包括sf-9在内的昆虫细胞，被感染的昆虫细胞 至少倉辦在内质网上异源表达权利要求1所述的P450 2B6药物代谢酶。本专利技术的有益效果在于，分离的，猴P450 2B6基因(《w 2B6)可以通过基因工程的手段在多 种宿主中异源表达。异源表达的蛋白仅代表2B6这一亚型，因此其代谢活性也仅反映该亚型的活 性。此外，本专利技术提供同是来源于錢猴的NADPH-细胞色素P450氧〗极原酶，与4顿其他种属的 氧化还原酶构建的体外检测系统相比，用这一氧化还原酶构建的系统显然更接近于食蟹猴体内代 谢的真实情况。附图说明图1是，猴P450 2B6基因(cyp 2B6)的RT-PCR结果图。 图2是pFB-cynoP2B6的PCR鉴定结果图。 图3是重组食蟹猴P450 2B6杆状病毒的PCR鉴定结果图。 图4是食蟹猴P450氧化还原酶的RT-PCR结果图。 图5是pFB-DU-cynoP2B6-0R重组质粒的双酶切鉴定结果图。 图6是pFB-DU-cynoP2B6-0R重组杆状病毒的PCR鉴定结果图。 具体实駄式实施例1.維猴药物代谢酶P450 2B6基因(cj^ 2B6)的克隆根据已经发表的人P450 2B6基因序列(Genebank， Accession NO. :NM_000767)，设计以下引物引物1: 5，- ATGGAGCTCAGCGTCCTC -3， 引物2: 5，-CCTTCAGCGGGGCAGG-3，5以逆转录自食蟹猴肝RNA的cDNA为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食蟹猴的Ｐ４５０ ２Ｂ６药物代谢酶，能催化盐酸丁氨苯丙酮的羟基化与３－甲基苯乙妥因的Ｎ端脱甲基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴仁科，佘妙琴，王海涛，温鼎声，白杨，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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