本发明专利技术内容涉及用于在乳酸菌中制备重组载脂蛋白的组合物和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1. 相关申请的交叉引用本申请根据美国法典第35编第119条e款要求2005年8月26曰提 交的序列号60/712,295的美国申请的权益，其内容通过引用并入本申请。2.
技术介绍
循环胆固醇通过两种主要的胆固醇载体—低密度脂蛋白(LDL)和高 密度脂蛋白(HDL)来运输。认为LDL负责从肝脏(在其中它被合成或 获自食物来源)运输胆固醇至机体的肝外组织。认为血浆HDL颗粒作为 组织胆固醇的清道夫(scavengers)在胆固醇调节中起主要作用。动脉粥样硬化是一种进行性疾病，其特征为动脉壁中胆固醇积聚。动 脉粥样硬化病变中沉积的脂质主要来源于血浆LDL,因此，通常将LDL 称为"坏，，胆固醇。相比之下，HDL血清水平与冠心病负相关，且因此，认 为高血清水平的HDL是负危险因素。因此，通常将HDL称为"好，，胆固醇。HDL的保护机制的最新研究集中于HDL的主要组分一载脂蛋白 A-I(ApoA-I)。高血浆水平的ApoA-I与冠心病的缺无或减轻有关(Maciejko 等，1983, N Engl J Med 309:385-89; Sedlis等，1986, Circulation 73:978-84)。 然而，考虑到低的制备总产率，ApoA-I的治疗用途和ApoA-I的已知变体 以及重构的HDL受治疗给药所需的大量载脂蛋白和蛋白质制备的成本限聚的ApoA-I的可选方法。3.
技术实现思路
本
技术实现思路
提供了用于制备无内毒素的重组载脂蛋白的组合物和方法。可使用本文所述方法制备的重组载脂蛋白包括但不限于ApoA-I、 ApoA-II 、 ApoA-IV 、 ApoA-V以及ApoE的前原载脂蛋白形式；人类ApoA-I 、 ApoA-II、 ApoA-IV以及ApoE的前体形式和成熟形式；以及活性多晶形 式、异构形式、变体和突变体以及截短形式，其中最常见的是ApoA-IM (APOA-Im)和ApoA-Ip (ApoA-Ip)。在某些方面，本
技术实现思路
提供了表达载体、包含所述表达载体的宿主 细胞以及使用所述载体在不产生内毒素的细菌例如乳酸菌中制备感兴趣 的载脂蛋白的方法。合适的乳酸菌包括但不限于乳球菌亚种(丄actococc^ 卿.)、链球菌亚种(5W; tococ譜卿.)、乳杆菌亚种(丄actok7"-肠卿.)、 明串珠菌亚种(Z^wco"ostoc spp.)、 片球菌亚种(/Ve&ococcws ^/7.)、短杆菌 亚种(J5rev/Z)"c&n'w附jp/ .)k乂及丙酉交冲干菌亚种(尸rop/o"/6acten'w附s/ p.)。合适 的调控核芬酸序列与编码载脂蛋白的核苷酸编码序列操作性连接以在乳 酸菌中表达载脂蛋白。调控核苷酸序列包括但不限于组成型启动子和可调 节(即诱导型)的启动子。在某些实施方案中，调控序列包括乳酸菌调控 序列。在某些方面，所述方法包括构建重组乳酸菌的步骤，所述重组乳酸菌 包含编码载脂蛋白并与合适的调控核苷酸序列操作性连接以控制编码序 列的表达的核苷酸序列，所述方法还包括在有效表达载脂蛋白的条件下培 养所述重组乳酸菌和从所述乳酸菌或从培养基中收集载脂蛋白的步骤。所述重组载脂蛋白可用于治疗和/或预防多种疾病和病症，包括血脂 障碍，和/或与之有关的各种疾病、疾患和/或病症。4.详细描述在候选治疗蛋白的高通量早期发现和高产率制备中，广泛使用基于大 肠杆菌(E. coli)的表达系统。然而，并非所有蛋白都能够使用大肠杆菌 作为宿主生物体高产率制备。另外，成功的大肠杆菌重组蛋白的表达/纯 化取决于能够使纯化的蛋白无污染物例如内毒素的高保真系统。常检测不 到获自大肠杆菌的纯化蛋白样品中内毒素的存在。另外，常用于去除污染 物的方法例如阴离子交换色谱不能去除内毒素。见例如McKinstry等，2003,Biotechniques 35:724-6。大肠杆菌中载脂蛋白A-I的产量低，见例如美国专利No. 5,059,528及 其引用的参考文献；还可见McGuire等，1996, J Lipid Res. 37:1519- 1528; Panagotopulos等，2002, Protein Expr Purif. 25:353-61;以及Ryan等，2003, Protein Expr Purif. 27:98-103。去除内毒素所需的纯化步骤可甚至更加减低 产率。根据大肠杆菌中表达的重组蛋白，消除污染的内毒素并实现符合动 态药品生产管理规范(cGMP)的纯度水平是不可能的。见例如Ma等， 2004, Acta Biochim Biophys Sin. 36:419-24。例如，载脂蛋白A-l结合内毒 素(脂多糖(LPS))并中和其毒性(见例如Ma等，2004, Acta Biochim Biophys Sin. 36(6):419-24)。因此，开发能够使纯化的重组载脂蛋白无内毒 素的大肠杆菌高保真度系统是不可能的。载脂蛋白在其他表达系统如酵母 和昆虫细胞中的产量也低。见例如美国专利No. 5,059,528及其引用的参 考文献。本
技术实现思路
提供了用于在不产生内毒素的细菌如乳酸菌中制备重组 载脂蛋白的组合物和方法。使用非内毒素细菌例如乳酸菌制备载脂蛋白的 优点包括(1)无内毒素，内毒素是大多数革兰氏阴性细菌细胞壁的组分， 但不作为细胞壁组分存在于乳酸菌中；(2)可利用不产生细胞外蛋白酶的 乳酸菌菌抹包括乳酸乳球菌株；(3)操作乳酸菌容易；(4)乳酸菌分泌稳定 且较易于纯化的重组肽、多肽或蛋白的能力；(5)利用发酵代谢(即在缺 乏氧气的情况下发生发酵)，发酵代谢通过减轻或消除对避免集中的氧气 袋所需的特别设计的设备(如果存在，可减少细胞生长并减低产率)的需 要来简化蛋白生产的规模放大；(6)可利用诱导型表达系统来增加表达的 基因产物的产率；以及(7)乳酸菌在食品工业中安全使用的长久历史，使 得它们成为制备治疗蛋白例如载脂蛋白的具有吸引力的克隆宿主。4.1乳酸菌根据上述，本
技术实现思路
提供了用于在乳酸菌中表达载脂蛋白的组合物 和方法。如本文所使用，术语"乳酸菌"是指革兰氏阳性、微需氧或厌氧菌， 其发酵糖而产酸，包括作为主要产生的酸的乳酸。通常，所述方法和组合 物利用工业上使用的乳酸菌，例如乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。属于严格厌氧类的产乳酸菌一双歧杆菌(即双歧杆菌亚种(^y^o^&n^m^; .)，也 可包括在乳酸菌家族中，其通常单独或结合乳酸菌用作食品发酵剂。应知道其他不产生内毒素的细菌包括本领域技术人员已知的其他革 兰氏阳性细菌可用于制备重组载脂蛋白，使得重组载脂蛋白的制备范围不 限于上述的乳酸菌。可将重组乳酸菌构建成包含编码载脂蛋白的核苷酸序列。使用本领域 公知的方法可将编码载脂蛋白的核苦酸序列任选连接至合适的调控核普 酸序列以调节编码序列的表达(见例如Sambrook等，1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)。另夕卜，已经分析了来自不同乳酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够在乳酸菌中表达的表达载体，其包含编码载脂蛋白的核苷酸编码序列，和与其操作性连接以控制所述核苷酸编码序列表达的一个或多个调控核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉恩路易斯达瑟优克斯，
申请(专利权)人：科莱尼斯医疗控股公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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