丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/C67的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种丙肝病毒特异性核酶Ｍ１ＧＳ－ｈｃｖ／ｃ６７的构建方法，是选取丙型肝炎病毒ＨＣＶ基因组５’ＵＴＲ中６８～８０ｎｔ之间的序列作为靶位点设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶Ｐ共价相联构建得到。通过选择丙肝病毒６８～８０ｎｔ之间序列作为侯选靶位，成功设计引导序列与之有效结合，依此而设计的核酶对底物显示出明显的靶向切割活性，所述核酶的成功构建为后续的实验为提供准确可依的实验材料，从而为新型抗ＨＣＶ药物及反义基因治疗的研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种丙肝病毒特异性核 酶M1GS-hcv/c67及其构建方法和应用。技术背景目前，基于核酶P (RNase P)的反义技术在抗病毒研究领域受 到广泛重视，国内外一些学者采用这类技术对包括人类巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒、艾滋病毒、流感病毒等在内的多种病毒进行过研究， 均发现其具有高效、特异性抑制病毒特定基因表达的作用，从而表明 该技术在抗病毒领域的巨大潜力。核酶P是广泛存在于各种生物细胞 (包括真核细胞、原核细胞及古细菌)内的一种天然大分子核酶，该 核酶在细胞内具有分布广、含量丰富、活性高而稳定等特点，其主要 生物学功能是负责前体tRNA (ptRNA) 5'前导序列的特异性切除， 以促进tRNA的成熟。对于任何序列已知的靶mRNA，理论上可设计一 段相应的引导序列(Guide sequence, GS)与之结合并使之形成类似 于ptRNA分子的结构，从而被核酶P识别并切割。与其他类型的核酶相比，RNase P主要识别底物特定的二级结构。 因此，即便靶基因一级结构的序列产生一定变异，但只要不引起其中 某些特定二级结构基序的变化，仍可被RNase P识别并切割，这对于 一些易变异病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。丙型肝炎病毒(H印atitis C virus, HCV)属黄病毒科，基因组为正单链RNA，全长约9600nt。是一种慢性化率极高的肝炎病毒，变 异性极高，在其自然感染的过程中可持续突变，产生不同的型或亚型， 以致于在同一 HCV感染者体内可同时存在具有多种序列组成不同但 却有很高同源性(同源性》95%)的HCV变异株病毒群体，称为HCV准 种(Quasispecies)。丙型肝炎病毒常引起肝硬化及肝癌，对人类健康 造成重大危害。目前对该病毒尚未有特异有效的防治方法，常规的干 扰素疗法疗效不甚理想且易反复，探索新的防治方法具有重要意义。 因此，采用RNase P技术对HCV进行抗病毒研究并构建HCV特异 性的人工核酶对于丙型肝炎病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是填补现有技术的空白，提供一种丙肝病毒特异性 核酶M1GS-hcv/c67的构建方法。本专利技术的另一个目的是提供通过所述构建方法构建得到的丙肝 病毒特异性核酶的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案来予以实现提供一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c67的构建方法，选取 丙型肝炎病毒HCV基因组5， UTR中68 80nt之间的序列作为耙位点设计引导序列，将弓I导序列与大肠埃希菌核酶P共价相联构建得到。所述靶位点为C67。所述引导序列为5， -AGACGCTTTCTGC-3，。 根据任何序列己知的靶mRNA，可设计一段相应的引导序列(Gui de sequence, GS)与之结合并使之形成类似于ptRNA分子的结构，从而被核酶P识别并切割的理论，本专利技术在大肠埃希菌(E.coli)核酶P 的基础上，针对HCV基因组5， UTR设计一段GS序列，进一步将两者共价相联，成功构建了一种HCV特异性的人工核酶""M1GS-HCV/C67， 并在此基础上对该人工核酶的体外切割活性进行了测定。所述丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c67的构建方法包括以下步骤(1)设计引导序列；依据GS的设计原则，选取HCV基因组5， UTR中68 80nt之间 的序列作为靶位点来设计GS，该区序列为5' -GCAGAAAGCGTCT-3'。所述靶点称为C67，针对C67靶点所设计的GS序列为 5， -AGACGCTTTCTGC-3，。本专利技术选择背景相对比较清楚、来源于大肠埃希菌的RNase P作 为工具，针对HCV基因组序列较为保守区的5' UTR，成功将具有引 导作用的GS序列与具有催化活性的RNase P亚基^M1 RNA共价结合在一起，构建了一种人工核酶^M1GS-HCV/C67。在设计GS时，靶位的选择极为关键。所选择的靶位既要符合被 RNase P切割所需的序列特征，同时也要考虑是否存在空间上的障碍。 由于HCV 5' UTR具有极其复杂的二级结构，因此后一要素显得尤为 重要。本专利技术在设计之前首先利用计算机软件(RNAstmcture 4.5) 对底物RNA的二级结构进行模拟，并尽量将其中结构简单的长单链区 选择作为候选靶位，目的是为了提高GS设计效率。本专利技术选择HCV 基因组5' UTR 68 80nt作为GS结合的靶位，将依此而设计的GS序列巧妙与大肠杆菌RNase P的催化亚基(M1RNA)的3，末端共价结 合，与此同时还在M1 RNA和GS之间引入一段长88nt的桥序列、以 及在GS的3'末端引入CCA基序。本专利技术依此而设计的核酶对底物 显示出明显的靶向切割活性。(2) 以含MlRNA基因的pFL117质粒为模板，通过引物进行PCR扩增，获得MIGS- HCV/C67的基因片段；以含M1 RNA基因的pFL117质粒为模板，通过引物P1、 P2进行PCR扩增，即可获得MIGS- HCV/C67的基因片段。由于引物Pl针对 的是pF117质粒中的T7启动子序列，引物P2针对是pF117质粒中 Ml RNA基因下游约88bP处的一段序列，并含有针对C67靶位的GS 序列，因此该M1GS核酶基因的结构如附图l所示。引物Pl: 5， - GATGGTACCTAATACGACTCACTATA -3，和P2: 5， -GTMGCTTGGTAGACGCTTTCTGCTGTGGMTTGTGAGC-3，由上海英竣公 司合成。(3) 以限制酶Kpnl和Hind III对所述基因片段及pUC19质粒 载体进行双酶切，并通过T4 DNA连接酶将两者连接，构建得到含 M1GS-HCV/C67基因的重组质粒。本专利技术同时提供了所述方法构建得到的丙肝病毒特异性核酶 M1GS-hcv/c67对靶RNA产生定点、特异性切割作用在制备抗病毒药物 方面的应用。本专利技术的有益效果是，通过选择丙肝病毒68 80nt之间序列作为 侯选靶位，成功设计引导序列与之有效结合，依此而设计的核酶对底物显示出明显的靶向切割活性，所述核酶的成功构建为后续的实验为提供准确可依的实验材料，从而为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究奠定基础。附图说明图l本专利技术构建的丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c67结构示意2 M1GS-HCV/C67质粒的1X琼脂糖凝胶电泳3核酶转录产物5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(含7mol/L脲素，银染)图4 a-"P标记的底物RNA的8X变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(含7 mol/L的脲素，同位素成像扫描)图5核酶M1GS-hcv/c67对底物RNA的体外切割(8。/^变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳图，含7mol/L的脲素，同位素成像扫描)具体实施方式下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本专利技术。 实施例l丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c67的构建及切割活性测定 1材料 材料1. 1酶及试剂限制性核酸内切酶(Kpn I、 Hind III、 Xba 1)、 T7 RNA 聚合酶、DNA酶I(RNase free)购自Fermentas (MBI)公司；Ex Taq 酶、绿豆芽核酸酶、T4 DNA连接酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙肝病毒特异性核酶Ｍ１ＧＳ－ｈｃｖ／ｃ６７的构建方法，其特征在于是选取丙型肝炎病毒ＨＣＶ基因组５’ＵＴＲ中６８～８０ｎｔ之间的序列作为靶位点设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶Ｐ共价相联构建得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李红枝，张文军，宁容，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]