用于生产重组促性腺激素的无血清培养基制造技术

本发明专利技术属于重组蛋白制造领域。更具体说，本发明专利技术涉及含抗氧化剂的无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途。所述抗氧化剂可选自：Ｌ－谷胱甘肽、２－巯基乙醇、Ｌ－甲硫氨酸、和抗坏血酸与（＋）－α－生育酚的组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产重组促性腺激素的无血清培养基专利
本专利技术属于重组蛋白制造领域。更具体说，本专利技术涉及含抗氧化剂的无血清培 养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途。所述抗氧化剂可选自L-谷胱苷肽、2-巯基乙醇、L-甲硫氨酸、及抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合。 专利技术背景本专利技术涉及重组促卵泡激素(FSH)的生产。FSH属于促性腺激素类。可用FSH来治疗男性和女性患者的不育和生殖疾病。采用FSH诱导女性患者 排卵(OI)和受控性超排卵(COH)，例如辅助生殖技术(ART)。在诱导排卵的典型治 疗方案中，患者每日注射给予FSH或其衍生物(每日约75-300IU的RFSH),时间约 为6-12天。在受控性超排卵的典型治疗方案中，患者每日注射给予FSH或其衍生 物(每日约150-600IU的RFSH)，时间约为6-12天。还采用FSH诱导患有少精液症 男性产生精子。采用每周3次150IU的FSH联合每周2次2500IU hCG的治疗方 案己成功使患有低促性腺激素性性腺功能减退的男性精子数量得到提高。鉴于FSH 在治疗生育疾病中的重要性，提供高稳定性和高比活性的FSH成为当务之需。FSH天然由脑垂体腺产生。为了药学应用，可用重组方法产生FSH(rFSH)或可 从绝经期后的女性尿液中分离获得(uFSH)。制备rFSH的过程必然有二个主要步骤: 培养基因工程改造的表达FSH的细胞，和纯化该蛋白质。然后将该蛋白与药物学 上可接受的运载体一起配制而获得药物组合物。为了培养细胞，过去通常在培养基中添加作为所有哺乳动物细胞系生长和维持 的通用营养物的血清。但是，潜伏期或培育期长的传染性牛神经变性疾病一牛海绵 样脑病(BSE)的出现引起了监管方(regulatory)对生物学活性产品生产中使用动物来 源血清的关注。因此，目前优先采用无血清培养基来生产重组蛋白。这种培养基为 本领域内所熟知，已有多家公司有商品供应，例如Sigma(西格马)、BioWhittaker(百 欧怀塔克)、GibcoBRL(吉比蔻)、Cambrex(凯布莱克司)和JRH。在贮藏rFSH时所遭遇的问题之一是存在FSH的氧化形式。为部分地解决这个问题，可在此药物组合物中添加抗氧化剂使FSH蛋白在将其给予需要治疗的患者之前稳定贮藏。例如，欧盟专禾U EP 0 853 945(Skrabanja和Van den Oetelaar, 1998)描述了将含促性腺激素的液体制剂与稳定剂(例如，25-100mM的柠檬酸钠和 l-10mM的L-甲硫氨酸)相混合的方法。已证明这种剂型使FSH制剂得以长期贮藏。 专利WO 92/15614(Takruri H,1992)也提及抑制液体或半液体药物组合物(例如贮存 培养基或眼用水性溶液)中多肽氧化的方法。更具体说，WO 92/15614显示含浓度 10mg/L的L-甲硫氨酸的眼药水或眼用软膏能稳定人表皮生长因子。然而上述文献 只公开了抗氧化剂在药物制剂中的应用，没有提及在培养基中的应用。也可在培养基中加入具有抗氧化活性的氨基酸和化合物，作为营养成分或可保 护细胞系防止细胞死亡。例如美国专利N0.4,560,655公开了一种含浓度约30mg/L 的L-甲硫氨酸的无血清培养基，可用这种培养基培养猪睾丸细胞、AG14骨髓瘤细 胞和鼠脾细胞。专利WO 95/12664描述了一种在特定细胞系中克服由于各种生长 限制因子量不足所致危害的方法，这些生长限制因子之一为氨基酸甲硫氨酸。更具 体说，W095/12664描述了一种使表达人M-CSF的CHO E5F3G细胞系适应细胞 高密度生长的方法。在此法中，CHOE5F3G细胞在含有104mg/L的L-甲硫氨酸 的培养基中生长(参见实施例和表2)。 Yun等描述了在培养基中加入谷胱苷肽和铁 螯合剂的组合能减少CHO细胞的细胞死亡(Yun等，2003)。 Saito等也描述了培养 基中可采用多种抗氧化剂以保护细胞系防止细胞死亡(Saito等，2003)。然而，WO 95/12664、美国专利NO. 4,560,655、 Yun等和Saito等都没有提到氨基酸、谷胱苷 肽和铁螯合剂对细胞系所产生的重组蛋白氧化状态的潜在影响(如果有任何影响的 话)。总之，这些文献只公开了采用L-甲硫氨酸或谷胱苷肽与铁螯合剂组合来促进 培养细胞的生长和/或活力。WO 99/50390涉及用于由白细胞生产干扰素-ot的培养基，所述培养基含甲硫氨 酸。HPLC证明了由于培养基中加入了甲硫氨酸，纯化后的干扰素-a蛋白质量得到 提高。WO 99/50390的专利技术人假定这种提高可能是由于减少了干扰素-a蛋白的氧 化。WO 99/50390还说明了甲硫氨酸用量太低导致效力降低，而用量太高可导致 干扰素产率降低。具体说，WO 99/50390教导了用白细胞生产干扰素-oc时，浓度范 围约为50-100mg/L是特别优选的范围。另外，WO 99/50390只考虑了生产单体蛋 白质干扰素-a的培养基。WO 99/503卯既没有提及也没有提出生产二聚体激素(例 如只在二聚体化后才能分泌的FSH)的培养基(Matzuk等，综上所述，上述文献都没有涉及在无血清培养基中采用抗氧化剂来减少二聚体 促性腺激素的氧化。专利技术概述本专利技术依据在制备rFSH过程中意外发现细胞培养上清液中出现氧化形式的 rFSH。而且，用无血清培养基生产rFSH可导致比用含血清培养基生产rFSH更高 水平的氧化形式。在本专利技术的框架中，我们惊奇地发现不仅可在贮藏过程中而且可 在培养步骤中降低氧化形式rFSH水平。实现这种降低不会损害产量。可通过在培 养基中加入抗氧化剂来实现这种降低。具体说，已发现在培养表达rFSH的细胞过 程中在无血清培养基中添加(i)2-巯基乙醇、(ii)抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合， (iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-谷胱苷肽中的任一种可以降低氧化形式rFSH水平。因此，本专利技术第一方面涉及无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用 途，其特征在于，所述培养基包含一种选自以下的抗氧化剂-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-15mg/L的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。本专利技术第二方面涉及在重组二聚体促性腺激素的制备过程中减少氧化形式重 组二聚体促性腺激素水平的方法，其特征在于，用含抗氧化剂的无血清培养基培养 表达所述重组二聚体促性腺激素的细胞。本专利技术第三方面涉及一种用于生产重组二聚体促性腺激素的无血清培养基，其 特征在于，所述培养基包含一种选自以下的抗氧化剂-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-15mg/L的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。专利技术详述本专利技术源自发现在含有抗氧化剂的无血清培养基中培养表达rFSH的细胞能显 著减少氧化形式rFSH水平。如实施例3中所示，在培养过程中(i)2-巯基乙醇、(ii) 抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合物，(本文档来自技高网...

【技术保护点】
无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培养基包括选自以下的抗氧化剂：　　　　－浓度范围约１－２０ｍｇ／Ｌ的Ｌ－谷胱苷肽；　　　　－浓度范围约５－１５ｍｇ／Ｌ的２－巯基乙醇；　　　　－浓度范围约２００－４００ｍｇ／Ｌ的甲硫氨酸；和　　　　－浓度范围约１０－５０ｍｇ／Ｌ的抗坏血酸和浓度范围约为５－２５ｍｇ／Ｌ的（＋）－α－生育酚的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JP丰塔，P杜库姆恩，V德帕里斯，
申请(专利权)人：阿雷斯贸易股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]