将基因转移入脂肪细胞或祖代脂肪细胞的方法技术

一种将基因转移到脂肪细胞或祖代脂肪细胞中的方法，包括在存在在分子中兼具逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质与具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或祖细胞，其中所述目标细胞结合位点具有能够结合ＶＬＡ－５的区域和／或能够结合ＶＬＡ－４的区域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及以高效率将基因转移入脂肪细胞或前脂肪细胞的技 术，其在药物、细胞技术、遗传工程等等领域是有用的。
技术介绍
在基因治疗中，难治的疾病例如由于细胞中"遗传信息错误"的遗 传性疾病，或癌症，例如通过提供正确的遗传信息来修复所述细胞的功 能，或通过添加细胞原先没有的新的"保护性基因"，被治疗或预防。在基因治疗中用作治疗基因的基因通常被转移到需要该基因的表 达的组织或器官中。这种情况的例子为其中CFTR基因被转移到患有嚢 性纤维化的患者中的呼吸上皮细胞内的治疗。在另一种情况中，可以不 考虑组织或器官来表达基因。例如，已经进行了尝试来将编码因子VII的基因转移入骨骼肌细胞来在该细胞中产生因子vn以将其供应给血浆(非专利文献1)，因子VII是血浆中的血液凝固因子，已知在肝脏中产生。其中在存在与逆转录病毒结合的功能性物质的情况下用逆转录病 毒感染目标细胞的方法，已经作为使用逆转录病毒载体以高效率感染目 标细胞的方法来开发(专利文件2、 3和4;非专利文献2)。在这种方法 中使用与目标细胞结合的物质或具有目标细胞结合位点的物质。对于脂肪细胞或前脂肪细胞，没有已知的功能性物质来提高逆转录病毒的感染 性。本专利技术的主要目的是开发有效地将外源基因转移到脂肪细胞或前 脂肪细胞中的方法，以及提供生产在治疗或预防疾病中有效的转化细胞 的方法。解决问题的手段本专利技术人发现，当使用功能性物质将脂肪细胞或前脂肪细胞以及逆 转录病毒载体共同局部化(colocalized)时，脂肪细胞或前脂肪细胞被逆转 录病毒有效地感染，所述功能性物质具有结合VLA-5和/或VLA-4的区 域。因而，完成了本专利技术。本专利技术概述如下。本专利技术涉及将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞 中的方法，所述方法包括，在存在在单个分子中具有逆转录病毒结合位 点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质 与另 一种具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源 基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或前脂肪细胞，其中所述目标细胞 结合位点含有能够结合VLA-5的区域和/或能够结合VLA-4的区域。例如，根据本专利技术使用的逆转录病毒结合位点可以来自选自由纤连蛋白的肝素-n结构域、成纤维细胞生长因子、V型胶原的胰岛素结合位 点、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖构成的组的物质。 来源于纤连蛋白的与VLA-5和/或VLA-4结合的区域可以用作根据 本专利技术的目标细胞结合位点。具有逆转录病毒结合位点和目标细胞结合 位点的物质例如是具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列以及SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和/或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽。根据本专利技术使用的逆转录病毒载体可以是复制缺陷的逆转录病毒 载体。本专利技术的效果 根据本专利技术，有可能有效地生产其中人工地掺入了有用的外源基因 的脂肪细胞或前脂肪细胞。这种细胞可以用于各种疾病的治疗，并且在 医学上是非常有用的。实施专利技术的最佳方式 本专利技术提供了使用逆转录病毒载体、通过将逆转录病毒载体和细胞 共同局部化，来提高将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的效率的方 法。在单个分子中具有逆转录病毒结合位点以及脂肪细胞或前脂肪细 胞结合位点的物质，或具有逆转录病毒结合位点的物质与另 一种具有脂 肪细胞结合位点的物质的混合物可以根据本专利技术来使用。对于逆转录病毒结合位点没有特别的限制，只要它具有与逆转录病毒载体结合的活性。例如，可以使用纤连蛋白的肝素-n结构域、成纤维细胞生长因子、V型胶原的胰岛素结合位点、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖， 等等。特别地，由具有来自纤连蛋白的肝素II结构域的逆转录病毒结合 位点的SEQ ID NO: 1(H-271)的氨基酸序列组成的多肽可以优选地使用。含有结合VLA-5和/或VLA-4的区域的物质可以用作脂肪细胞或前 脂肪细胞结合位点。对于所述区域的来源没有特别的限制。可以使用 VLA-5或VLA-4的已知配体，或识别VLA-5或VLA-4的抗体。可以优 选地使用来自纤连蛋白的结合VLA-5或VLA-4的位点。含有SEQ ID NO: 2(C-274)的氨基酸序列的多肽，或含有SEQIDNO: 3(CS-1)的氨基 酸序列的多肽是上述的例子。同时具有逆转录病毒结合位点以及脂肪细胞或前脂肪细胞结合位 点的功能性物质，或含有逆转录病毒结合位点的功能性物质与另 一种具 有脂肪细胞或前脂肪细胞结合位点的功能性物质的混合物，可以#4居本 专利技术使用。在特别优选的实施方式中，使用纤连蛋白衍生的重组多肽， 例如以下的CH-296(SEQ ID NO: 4),其具有SEQ ID NO: 1、 2和3 的所有氨基酸序列；H-296(SEQIDNO: 5),其具有SEQIDNO: l和3 的氨基酸序列；或CH-271(SEQIDNO: 6),其具有SEQIDNO: l和2 的氨基酸序列。做为另一种选择，可以使用H-271(SEQ IDNO: 1的氨 基酸序列的多肽)和C-274(SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽)的混合 物。CH-296、 H-296、 CH-271 、 H-271和C-274可以如J. Biochem.， 110:284-291(1991)中描述的来制备。CH-296可以以商品名 RetroNectm(注册商标)从Takara Bio商业上获得。对于使用所述功能性物质的方法没有特别的限制。例如，所述功能 性物质可以用来包一皮器皿的表面，所述器i用于逆转录病毒载体对细胞 的感染。可以使用已知的方法用于包被。对于根据本专利技术使用的逆转录病毒载体没有特别的限制。对于基因 转移，通常根据本专利技术使用人工修饰的重组逆转录病毒(即，逆转录病毒 载体)。特别地，为了防止不受限制的感染或基因转移，复制缺陷的逆转 录病毒载体是优选的。这种载体被制成复制缺陷的，使得它不能在受感 染细胞中自主复制，因而是无毒力的。这种载体可以侵入宿主细月包，例 如脊推动物细胞(特别是哺乳动物细胞)，来将插入到所述载体中的外源基因稳定地整合到染色体DNA中。已知的复制缺陷逆转录病毒载体的实例包括逆转录病毒载体(例如，MFG载体、cc-SGC载体(WO 92/07943) 、 pBabe(Nucleic Acids Research, 18:3587-3596(1990》、 pLXIN(Clontech)或pDON-AI(Takara Bio))、 t曼病毒载体(人类免疫在夹陷病 毒(HIV)衍生的载体、猿免疫缺陷病毒(SIV)衍生的载体，等等)和其修饰 体。对于逆转录病毒载体携带的外源基因没有特别的限制。期望在目标 细胞中表达的任何基因可以被插入。其实例包括编码多肽(酶、激素、生 长因子、细胞因子、受体、结构蛋白质，等等)、反义RNA、核酶、decoys 和引起RNA干扰的RNA的基因。如果本专利技术是用于基因治疗来进行 的，编码对于疾病的治疗或预防有用的物质的基因被转移到目标细胞 中。编码在细胞中产生然后转运出细胞(例如，当在血管中循环时)之后 发挥作用的多肽，例如分泌的酶、激素、生长因子或细胞因子的基因， 作为根据本专利技术转移到用作目标细胞的脂肪细胞或前脂肪细胞中的基 因，是优选的。根据本专利技术可能使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的方法，所述方法包括，在存在在单个分子中具有逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质与另一种具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或前脂肪细胞，其中所述目标细胞结合位点含有能够结合ＶＬＡ－５的区域和／或能够结合ＶＬＡ－４的区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：円居隆宏，榎龙嗣，佐川裕章，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]