人脑钠肽二联体［（ＢＮＰ）↓［２］］与人血清白蛋白（ＨＳＡ）的融合蛋白及其制备，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠ＰＣＲ技术，将串联的两个ＢＮＰ ｃＤＮＡ（简称（ＢＮＰ）↓［２］）和ＨＳＡ ｃＤＮＡ进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的（ＢＮＰ）↓［２］－ＨＳＡ ｃＤＮＡ融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主表达系统中进行表达。本发明专利技术的融合蛋白包括与人脑钠肽至少８５％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少８５％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人脑钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
人脑钠肽二联体与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物
技术介绍
脑钠肽(Brain Natriuretic P印tide， BNP)是由Sudoh等在1988年在猪脑中发现的利钠多肽家族成员， 它主要由心室分泌合成，前体含有108个氨基酸，力n.L:后释放出含有32个氨基酸的成熟BNP分子。BNP 的主要特性是拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用，即通过抑制肾素和醛固酮的分泌，增加肾小球滤 过率和抑制肾髓质集合管钠重吸收促进排钠、利尿。还可通过直接松弛血管平滑肌和拮抗血管紧张素II的作用而扩张血管，抑制平滑肌细胞增生影响血管重塑。静脉给予BNP能降低心力衰竭患者肺毛细血管楔 压(PCWP)、右心房压力、体循环血管阻力(SVR)，并能减轻水钠潴留，迅速改善血流动力学状态。2001 年8月美国FDA批准了重组人脑钠肽(rhBNP)药物一奈西立肽(nesiritide)用于临床治疗急性心力衰竭。 2005年10月，我国也上市了 rhBNP (商品名新活素)。像临床上已广泛使用的其它重组多肽/蛋A类药物一样，重组BNP药物溶解度低、稳定性差、体内半 衰期仅为22min，必须持续高剂量给药方能奏效。该类药物治疗费用高、药物利用度低，患者频繁注射， 导致其实际用量远地低于需求量。提示有必要重视长效BNP药物的研发，满足临床应用的需要。HSA作为人体血浆的主要成分在体内具有无酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期长(大约23天) 等优点。以HSA为载体的融合蛋白技术(Albumin Fusion Technology)受到重视。将HSA基冈和人干扰 素a2b (IFNa2b)基因融合，表达的融合蛋白HSA-IFNa2b在体内的平均半衰期达140h，且有很好的抗病 毒活性、安全性和耐受性。这种融合蛋白质一方面增加了药物分子量，降低了肾脏的排泄速率；另一方面， 融合的蛋白分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对普通lFNa2b的水解作用，从而有效地 延长了蛋白分子药物在循环系统内的滁留时间。通过改变药物的药代动力学特性，使得药物的血浆浓度更 加稳定，药物在体内维持的时间更长，从而达到提高药物疗效和降低副作用的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人脑钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本专利技术的融合蛋白 在保持了人脑钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。本专利技术的技术方案人工合成(BNP)2 cDNA;通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA; 利用重叠PCR技术，连接(BNP)2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的(BNP)rHSA cDNA 融合基因插入到克隆载体pBlu2KSP中保存；(BNP)2-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿 主细胞中进行表达。(BNP)2 cDNA的克隆，HSAcDNA的克隆，(BNP)2 cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆，融合蛋白(BNP)2-HSA的重组酵母构建和融合蛋白(BNP)rHSA的表达的步骤详见具体实施方法。用上述方法制备的人脑钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人脑钠肽至少85%序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人脑钠肽 同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不 加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人脑钠肽同源的第一 区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述融合蛋白包括与人脑钠肽至少95%序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95%序列 同源的第二区。所述融合蛋白的第二区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、经结构域重排后的人血清白蛋白组成， 包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA (l-n)， n 为369-419。所述融合蛋白包括与人脑钠肽氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的 第二区，或上述二区的功能等同物。所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或 加入得到的多肽。宿主细胞是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等。优选的宿主细胞是酵母。优选的酵母是 毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母GS115。由于(BNP)2基因较短，采用人工合成该基因。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增 获得。利用重叠PCR技术，连接(BNP)2 cDNA和HSAcDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽 加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的(BNP)2 cDNA和HSAcDNA融合基因插入到 克隆载体中保存。(BNP)2cDNA和HSAcDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细 胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体 中或插入到质粒中。本专利技术优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、 营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组 蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化 方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超 糖基化带来的免疫源性问题。毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9， pPIC9K， pHIL-Sl, pPICZa, pYAM75P6;胞内型 表达载体主要有pPIC3K， pPICZ， pHWOlO， pGAPZ， pGAPZa (invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分 泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、 A0X1启动子、MF a分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。A0X1启动子是一个强启动子，可以 高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOXl和AOX2，细胞中绝大多数乙醇 氧化酶的活力是由AOXl提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30%以上。AOX2 与AOX1的同源性虽然高达97%，但酶活很低。当AOXl基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧 化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本专利技术构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或BNP抗体检测培养液上清。本专利技术的有益效果利用重叠PCR技术，连接(BNP)2 cDNA和HSAcDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加 入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
人脑钠肽二联体［（ＢＮＰ）↓［２］］与人血清白蛋白（ＨＳＡ）的融合蛋白。其特征是包括与人脑钠肽至少８５％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少８５％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人脑钠肽同源的第一区位于融合蛋白的Ｎ末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的Ｃ末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的Ｎ末端，所述与人脑钠肽同源的第一区位于融合蛋白的Ｃ末端，中间不加任何连接肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，丁月娣，张莲芬，李英，储敏，陈蕴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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