本发明专利技术涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种能被恶性疟疾患者血清识别的具有多个表位的人工抗原的氨基酸序列以及编码所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明专利技术还涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本发明专利技术进一步涉及所述的人工抗原在用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫抑制剂中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。具体而 言，本专利技术涉及一种能被恶性疟疾患者血清识别的具有多个表位的人 工抗原的氨基酸序列以及编码所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本 专利技术还涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本 专利技术进一步涉及所述的人工抗原在用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫 抑制剂中的应用。
技术介绍
疟疾是当今世界上最致命的流行病之一。全世界有近40亿人生活 在疟疾流行区，每年大约有3-5亿新的感染者出现，并且造成每年约 2-4百万人死亡。在感染人类的4种疟原虫中，恶性疟原虫是造成上述 死亡的元凶，因此对恶性疟疾的防治无论对流行区人口健康还是对该 地区经济发展都具有重大意义。疟原虫的生活史可简单归纳为在人体内进行无性增殖、早期有 性增殖和在蚊体内的有性增殖与孢子增殖。从雌性按蚊C4/2op力Wes sp.) 叮咬入血，到在肝细胞内发育成熟，大量裂殖子(merozoite)从破裂 的肝细胞内逸出，进入血流，这时期称红前期(exoerythrocytic stage)。从血流中裂殖子侵入红细胞在其内发育增殖，到下一代疟原 虫经无性繁殖反复感染红细胞，称为红(细胞)内期(erythrocytic stage)。部分进入红细胞的裂殖子在红细胞内不再进行无性分裂，而 逐渐发育成为雌或雄配子体。如被雌性按蚊吸入胃内，则在蚊体内进 行有性增殖，发育成熟为子孢子逸出，统称为蚊期。疟原虫在上述不同生活周期表达多种不同的抗原蛋白。尽管研究 证实减毒子孢子能够引导产生免疫保护，由于疟原虫需通过宿主体内 繁殖，因此没有利用天然虫体制备疫苗的条件。对己经筛选出的疟原虫抗原蛋白的研究已证实，它们的抗原性在宿主免疫系统的压力下会 不断产生变异，因此目前没有任何一种抗原的单独使用能够达到预期 的保护效果。疟疾的临床症状只发生在红内期，可引起周期性寒战高热，贫血， 脾肿大，昏迷以致死亡。因此，针对红内期研制的抗疟疫苗被认为是 最有效的预防途径。恶性疟原虫生活周期的复杂性，以及恶性疟原虫 抗原的高度多态性，使人们把研究重点放在对保守性多表位疫苗的研 制上。因此，目前明显需要一种具有高免疫原性、抗原识别多样性、 同时具有高抑制率的疫苗。
技术实现思路
根据上述需要，本专利技术人构建出一种人工重组的核酸分子ES312， 包含编码SEQID No:2所示的323个氨基酸残基的全长多肽。因此，本专利技术涉及一种具有SEQIDNO: l所示的碱基序列的多核 苷酸。本专利技术还涉及具有由SEQ ID NO: 1所示的碱基序列编码的如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽。本专利技术进一步涉及含有所述的多核苷酸的载体。本专利技术进一步涉及含有所述的载体的大肠杆菌。其是于2004年10 月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229的大肠 杆菌。本专利技术进一步涉及它含有所述的多核苷酸或权利要求2所述的多 肽的疫苗。本专利技术进一步涉及对所述的碱基序列特异的抗体。 本专利技术进一步涉及对所述的多肽特异的抗体。 本专利技术进一步涉及所述的多核苷酸用于制备抗恶性疟原虫感染的 疫苗中的用途。本专利技术进一步涉及所述的多核苷酸免疫机体产生的抗体用于制备 抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。本专利技术进一步涉及所述的多肽用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗 中的用途。本专利技术进一步涉及所述的多肽免疫机体产生的抗体用于制备抗恶 性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。根据本专利技术提供的含有抗恶性疟原虫的多表位人工抗原的ES312 疫苗与现有技术的抗恶性疟原虫疫苗相比具有高免疫原性、抗原识别 多样性。另外，由所述的SEQIDNO: l所示的碱基序列的多核苷酸和 所述的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽所产生抗体对恶性疟原 虫的体外生长具有很高的抑制效率。保藏信息本专利技术所用的重组工程菌株已于2004年10月9日在中国科学院微 生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229和CGMCC1230。附图说明图1示出抗恶性疟原虫多表位人工抗原ES312疫苗的基因核苷酸 序列的975个碱基(即SEQ ID NO: 1)及其编码蛋白的323个氨基酸序 列(即SEQ ID NO: 2)。图2多表位人工抗原ES312的结构组成分析。A:多表位蛋白ES312 的不同种类表位的串联方式；B:多表位蛋白ES312的氨基酸序列的二 级结构预测。图3多表位蛋白ES312对20种恶性疟病人血清的识别。A:原核 表达蛋白ES312的纯化(1，镍柱亲合纯化前的His融合蛋白；2，纯 化后的His融合蛋白；3，肠肽酶切割His融合蛋白；4，镍柱亲合纯 化的蛋白ES312); B:蛋白ES312能有效地识别疟疾病人血清的酶联免 疫吸附实验ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)实验结果， 其中系列1:蛋白ES312与病人血清识别的光吸收值;系列2:蛋白ES312 与正常人血清识别的光吸收值。图4兔抗ES312蛋白的IgG抗体对多种恶性疟原虫天然蛋白的识 别。A:与天然虫体蛋白的免疫共沉淀(Preimmune表示免疫前兔IgG 抗体，Anti-ES312D表示免疫后IgG抗体)；B:免疫透射电镜(RBC表 示红细胞，Tr表示滋养体，小黑点表示Anti-ES312D的IgG抗体与天 然蛋白结合位点)。具体实施例方式本专利技术是在由相同申请人于2003年8月1日申请的申请号为 PCT/CN03-00620中披露的方法，利用选用恶性疟原虫不同生活时期的抗 原CPE， MSA-2， RESA， EBA-175， LSA-l, CST3/CSP, MSP-1, AMA-l和MAg-1 的14个表位，以人类密码子的偏爱性进行设计表位相应的基因序列 ES312，从不同生活时期的恶性疟原虫保护性抗原中选出9种表位，它们 是MSA-2， RESA， EBA-175， LSA-1， CST3/CSP， MSP-1,纖-1， CPE 和MAg-1,通过人工合成抗原蛋白ES312的相应基因，合成筛选出SEQID N0:1所示的核苷酸序列。另外，本专利技术SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 还可以通过本领域任何常规的方法产生，所产生的本专利技术序列都包含在 本专利技术的范围之内。用本专利技术SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列编码具有323个氨基酸序 列的蛋白质，如SEQ ID NO: 2所示，其相对分子量约为65kDa。编码ES312 蛋白的表位类型分析，发现在ES312蛋白的上游存在多个连续两个的B 细胞表位与Th细胞表位连接的组装方式(图2A)。其氨基酸序列二级结 构预测，亦发现序列上游存在有连续数个的转角-螺旋结构(即 Coil-Helix, CH)，如图2B所示。真核表达载体质粒VR1012连接后(VR1012 为vical公司的真核表达载体)，感受态转化大肠杆菌SKS383菌株，在 终浓度为25pg/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得含重组质粒工程 菌ES312-VR1012/SK383。该重组工程菌株已于2004年10月9日在中国 科学院微生物保藏中心保藏保藏，保藏号为CGMCC1229和CGMCC1230。但 上述方法产生的如SEQ ID NO: 2的氨基酸序列并非限本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多核苷酸，它具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王恒，蔡启良，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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