一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法技术

一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了酿酒酵母中缺少木糖还原酶，不具备木糖代谢能力，不能有效发酵植物纤维水解液的问题。构建方法：先克隆ＸＹＬ１基因、ＡＤＨｔ基因序列和ＫａｎＲ基因；再回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，分别与载体连接；然后构建质粒ｐＡＤＨ、质粒ｐＡＫ；再将ＸＹＬ１基因引入质粒ｐＡＫ，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。本发明专利技术方法将木糖还原酶基因ＸＹＬ１和乙醇脱氢酶的强启动子的终止子序列构建于同一个质粒载体上，在增添了木糖代谢为乙醇的途径外，还抑制了木糖代谢为木糖醇，能够介导酿酒酵母高效代谢木糖生产乙醇。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆休哈塔假丝酵母菌的ＸＹＬ１基因；二、克隆质粒ｐＫＴ０１５０中的ＡＤＨｔ基因序列；三、克隆质粒ｐＫＴ０１５０中的ＫａｎＲ基因；四、回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，然后在分别与ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体在１６℃的条件下连接１０～１２ｈ，得到ｐＧＭＴ－ＸＹＬ１、ｐＧＭＴ－ＡＤＨｔ和ｐＧＭＴ－ＫａｎＲ；五、构建质粒ｐＡＤＨ，以酿酒酵母整合质粒ｐ４０６ＡＤＨ１为骨架引入ＡＤＨｔ基因；六、构建质粒ｐＡＫ，将ＫａｎＲ基因引入质粒ｐＡＤＨ中；七、将ＸＹＬ１基因引入质粒ｐＡＫ，即得到表达木糖还原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为５’－ＡＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＧＣＣＣ－３’，下游引物序列为５’－ＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＧ－３’；步骤二中扩增上游引物序列为５’－ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴ－３’，下游引物序列为５’－ＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＧ－３’；步骤三中扩增上游引物序列为５’－ＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣ－３’，下游引物序列为５’－ＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡ－３’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：平文祥，葛菁萍，凌宏志，杜春梅，宋刚，赵丹，高冬妮，于新，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]