肝实质细胞的冷冻保存制造技术

本发明专利技术涉及用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，用于冷冻保存分离的肝细胞的方法和用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的培养物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及冷冻保存
，特别涉及用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，用 于冷冻保存分离的肝细胞的方法和用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的夹心培养物的方 法。
技术介绍
从组织复合体中分离出的肝细胞(liver cells),特别是肝实质细胞(hepatocytes),以原 代细胞培养物的形式特别用于测试候选药物的生理作用。从人体新鲜制备的原代肝实质细 胞特别代表用于在体外系列试验中确定候选活性物质或进行活性物质代谢或酶促研究的 "金标准"。不利的是，新鲜分离的人肝实质细胞不能常规和任何时间得到。因此，需要能 将分离的肝实质细胞储存一定时间的方法。在这里，细胞的生理功能，尤其是它们的代谢 或酶能力，应尽可能完全予以保留。众所周知，肝实质细胞都以冷冻保存方式储存。 一般而言，肝实质细胞是在悬浮液中 冷冻保存的。除了肝实质细胞，悬浮液还含有冷冻剂，用于防止冻融时损害细胞。为了储 存，悬浮液通常冻结在低于-8(TC的温度。为了储存后的使用，冻结的细胞悬浮液解冻， 细胞涂布在培养板上或培养器皿中。为了再培养解冻的细胞，培养器皿一般包被基质材料， 细胞可粘附其上。成功的粘附对于再培养和随后的研究来说是至关重要的。不过，通常只 有小部分原先冻结的细胞可以以活的状态保存下来并进行再培养。这种方法的不利之处特 别在于这样的事实不能预见来自悬浮液的解冻的细胞是否或以什么比例粘附到培养板上。 在一个批次中粘附细胞的比例是依赖于该个体批次的。有规律的，仅少量批次的解冻的冷 冻保存的细胞充分粘附到培养板上。用于冷冻保存的已知的更进一步的方法在于在培养器皿中涂布新鲜分离的细胞以便随 后冻结连带培养器皿的涂布的细胞。在涂布前，这里的培养器皿也包被可粘附细胞的基质。 众所周知，最好采用胶原凝胶。在一个已知的方法中，肝实质细胞接种到包被I型胶原的 培养板上并允许约4个小时粘附到胶原基质上。然后由此产生的单层培养物(单层细胞培 养物)培养大约20小时。随后，洗掉不粘附的细胞。再经过6小时，培养物上覆盖一层冻 结剂，冷却到-70。C并储存(Watts and Grant, 1998; Human & Experimental Toxicology 15:30-37)。为了随后的使用，单层培养物解冻并再培养。但是，该解冻的培养物含有高比例 的不粘附的和无生命的细胞和细胞碎片。虽然通常大部份基质覆盖了细胞，并没有形成融 合连续的细胞区域。在另一已知的方法中，肝实质细胞被冻结在夹心结构中，即是在双重凝胶设置中。为 此，肝实质细胞悬浮液首先接种在包被胶原凝胶的细胞培养板上。细胞培养24小时后，第 二层胶原凝胶倒在接种细胞上。随后，由此获得的夹心培养物在冷冻剂中于-70。C冻结并储 存(Koebe et al.， 1990; Cryobiology 27: 576-584 )。通过冻结前肝细胞固定在一基质上或两基质之间，机械稳定细胞，存活率由此提高。 由于细胞在新鲜分离、高活力状态时能够粘附这样的事实，与在悬浮液中冻融的冷冻保存 的细胞的粘附相比，粘附率显著增加。尽管这样，解冻后出现了过大比例的不粘附的或无 生命的细胞。没有实现有活力的肝实质细胞的融合培养物的理想状态。而且，看到冷冻在 悬浮液中的细胞通常在解冻后几个小时内丧失它们的代谢能力。因而它们不适合用于大量 的体外试验。此外，从人体器官分离出的细胞通常没有从动物模型分离的细胞强壮。这一点尤其要 归因于这样的事实，即与来自动物的细胞相比，来自供体器官的人体细胞通常在不太有利 的条件下能得到，因为动物是通常专门饲养用于这个目的，然后安乐死的(比如大鼠、小 鼠或猪)。因此，到目前为止，人体细胞需要更温和的培养条件。到现在为止，没有已知的 冷冻保存方法，采用这些方法人肝实质细胞能够被成功冷冻保存，以便从而后来能够进行 较长时间的体外研究。因此，需要用于肝细胞冷冻保存的改进的方法，使温和的冷冻保存成为可能，尤其是 具有高存活率的温和解冻。 一种改进的冷冻保存的方法应该特别适合于成功冷冻保存分离 的人肝实质细胞。在这里应保证解冻的细胞可以在培养基质上大比例再培养，可能的话， 作为一融合单层(连续单层)。该方法应该进一步适合于能够制备分离的肝细胞的改进的夹 心培养物，其中含有高比例的活细胞。此外，应保证该冷冻保存解冻后再培养的细胞尽可 能长时间维持其代谢和/或酶能力，这样它们能被用于大量体外试验。
技术实现思路
因而本专利技术的技术问题在于提供改进的方法，用于冷冻保存分离的肝细胞，尤其是人 类肝细胞，以便冷冻保存的肝细胞能够最终作为改进的夹心培养物再培养。该技术问题通过一种如权利要求1提出的方法来解决，特别是一种用于制备适于冷冻 保存的肝细胞的方法，包括下述步骤在步骤(a)中，制备一种基质，尤其是胶原基质，较佳地是胶原凝胶。基质较佳地引 入到细胞培养器皿中，例如6孔板。培养器皿较佳地包被基质材料。 在步骤(b)中，制备分离的肝细胞，尤其是从组织分离的。在随后的步骤(C)中，分离的肝细胞接种在基质上。在基质上肝细胞的密度在这里是 从2 ~ 4x 103 cells/mm2基质表面。较佳的细胞密度是从2.6 ~ 3.2x 103 mm-2。也就是说，在一 具有9.6cn^底面积的培养器皿中，例如6孔板的一个孔的底部表面，接种细胞的数目是2.5 ~ 3xl()6每孔。在更进一步的，最好是立即随后的，步骤(d)中，使细胞静置在基质上(静置阶段、 粘附阶段)。为此，允许包被细胞的基质静置一段时间，约10-180分钟，较佳地30-90 分钟，特别优选地大约1小时，以便使接种在基质上的细胞能够粘附到所述基质。静置较 佳地发生在培养拒(培养箱)中，特别是在温度37°C、 5 %的C02和95 %相对湿度的标准 条件下。此外，成功的粘附能够通过显微镜检查核实。在步骤(d)中的静置后，没有粘附到基质的细胞在步骤(e)中从包被细胞的基质上 洗涤掉(洗涤步骤)，要特别仔细。洗涤较佳地是这样进行的通过在包被细胞的基质上覆 盖一层培养基，随后吸掉包括培养基和不粘附的细胞的上清液。这一步骤较佳地至少重复 一次。在进一步的步骤(f)中，使洗涤过的包被细胞的基质再次静置(第二静置阶段)。静 置至多180分钟的时间，尤其30至180分钟，特别优选地大约1小时。静置较佳地发生在 培养柜中，特别是在温度37。C、 5%的0)2和95%相对湿度的标准条件下。第二静置阶段后，包被细胞的基质在步骤(g)中在一冻结剂中进行冻结(冻结步骤)。 冻结前，第二静置阶段后，较佳地再次洗涤包被细胞的基质，尤其是以消除残留的不粘附 的细胞(洗涂步骤)。过程较佳地对应于步骤(e )。根据本专利技术的方法也提议在基质上以一定密度接种分离的肝细胞，经过某种静置阶段 和洗涤的顺序后，在冷冻剂中冻结不粘附的细胞。从而，冻结包被细胞的基质，尤其是胶 原基质，细胞粘附其上，尤其以单层形式呈现。通过根据本专利技术的手段，令人惊讶的，获 得了完整细胞的培养物，其可以被特别好地冻结，即冷冻保存。在这里强调根据本专利技术制 备和冷冻保存的培养物，在解冻后是特别活的(有活力的)，并含有高数量的粘附到基质的 细胞。这里，该解冻的细胞可以方便地以融合单层进行再培养。根据本专利技术的方法对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，包括步骤：（ａ）制备基质，（ｂ）制备分离的肝细胞，（ｃ）以２～４×１０↑［３］ｍｍ↑［－２］的密度在基质上接种肝细胞，（ｄ）包被细胞的基质静置１０～１８０分钟，以便细胞能粘附到基质，（ｅ）从包被细胞的基质上洗涤掉不粘附的细胞，（ｆ）包被细胞的基质静置最多１８０分钟，和（ｇ）在冷冻剂中冻结包被细胞的基质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢博米尔阿尔谢尼耶夫，克拉希米拉亚历山大德罗娃，马克巴托尔德，扎比内卡费特卡斯汀，布里塔劳贝，
申请(专利权)人：齐托内两合公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]