制备L-赖氨酸的发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸（ＰＣＡ）的培养基中进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌菌株的方法以及一种通过对所述菌株进行主培养来制备Ｌ－赖氨酸的发酵工艺。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种通过在添加有吡咯垸酮羧酸(PAC)的培养基中对棒 状杆菌属菌株进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌属菌株的方法，以 及一种通过主培养相同菌株来制备L-赖氨酸的发酵工艺。
技术介绍
L-赖氨酸是一种基本氨基酸，已经被用于动物饲料添加剂、食物添 加剂和药物成分。特别在2005年，作为动物饲料添加剂的L-赖氨酸在市 场中增加到大约有860,000吨，显示了 L-赖氨酸是生产发酵产品的重要因素。L-赖氨酸通过直接发酵进行工业化生产，其利用添加有碳源诸如粗 糖、葡萄糖和糖蜜(甘蔗、甜菜)和氮源诸如玉米浆液(CLS)、豆粕水 解液以及硫酸铵、维生素和矿物质的培养基。生产L-赖氨酸的常规方法已在专利文献中公开了；例如日本特许专 利公开号平4-66558描述了一种方法，其中将水中稀释的甘蔗糖蜜和 甜菜糖蜜通过阳离子交换树脂并且将洗脱液装载到发酵培养基中丛而增 加发酵物的浓度和L-赖氨酸的产量。日本特许专利公开号1982-026594 描述了一种利用棒状杆菌使转化酶与稀释的甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜在水中 反应，并利用其反应产物的发酵来生产L-赖氨酸的方法。
技术实现思路
技术问题专利技术人通过建立具有良好发酵效率的L-赖氨酸发酵的新工艺来实 现本专利技术。这通过向在添加有吡咯烷酮羧酸的培养基中对棒状杆菌属菌 株进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌属菌株的方法来实现。 技术方案本专利技术的目的在于，提供一种活化用于L-赖氨酸发酵过程的棒状杆 菌属菌株的方法。本专利技术的另一目的在于，提供一种利用活化的棒状杆菌属菌株来发 酵L-赖氨酸的工艺。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸 (PAC)的培养基中对棒状杆菌属菌株进行种前培养和种子培养来活化 棒状杆菌属菌株的方法。在本专利技术中，棒状杆菌属中的任何棒状杆菌属菌株都可以产生L-赖 氨酸。例如，谷氨酸棒状杆菌、可於棒状杆菌、黄色棒状杆菌和乳糖发 酵棒状杆菌中的菌株都可被利用。本专利技术的棒状杆菌属菌株优选为谷氨酸棒状杆菌(保藏号KFCC 11043)。本专利技术提供了一种活化棒状杆菌属菌株通过发酵生产L-赖氨酸的 方法，其中种前培养基和种子培养基添加有吡咯烷酮羧酸或者含有吡咯 烷酮羧酸的物质，并且棒状杆菌属菌株在上述培养基中培养。种前培养或种子培养之后，在主发酵工艺过程中没有必要向培养基中添加吡咯烷 酮羧酸，因为在种后培养中添加吡咯烷酮羧酸对发酵效率没有影响。一般说来，发酵过程由种前培养、种子培养和主发酵(主培养)三 个步骤组成。进行种前培养目的在于，为了高效生产在种子培养之前保证培养是 纯化的，并保持细菌的连续的活性。种子培养是种前培养和主发酵之间的中间过程，其目的在于增加细 胞密度和菌株活性。为了增加发酵工艺的效率，培养液的体积必须是主 发酵初始体积的5~30%，所以优选在主发酵工艺之前进行种子培养。种 子培养是培养种前培养纯化的培养物菌株，直到这些菌株完全被活化并 且其数量增加到足够用于主培养为止。种子培养液被直接用于主发酵工 艺。根据批量发酵工艺中，纯化分离的菌株可在小体积反应器中培养。 当菌株的数量达到一定水平时，将它们转移到大体积反应器中(在一些 情况下，该过程必须重复数次)。经过上述过程之后，产生了足够的用于 主培养的细胞和培养液，并且具有稳定的细胞活性。根据本专利技术，在主发酵工艺之前，将被认为是天然潮湿因子的吡咯 烷酮羧酸或者含有吡咯烷酮羧酸的物质添加到用于棒状杆菌属菌株的种 前培养或/和种子培养的培养基中，从而活化菌株。结果，主发酵工艺中 L-赖氨酸的产量也增加了。本专利技术中，单独加入吡咯垸酮羧酸，或者加入含有吡咯垸酮羧酸的物质。本专利技术中，种前培养和种子培养基中吡咯烷酮羧酸的含量优选为0.1 g/1到5g/1。含有吡咯烷酮羧酸的物质例如为动物皮肤、芦荟、甜菜等，且优选为甜菜糖蜜。种前培养和种子培养基中优选的甜菜糖蜜含量为5g/1到 100g/l。甜菜糖蜜中吡咯烷酮羧酸的含量大约为2%到3%。除了吡咯烷酮羧酸以外，诸如碳源、氮源和矿物质等都多种成分可 加入到种前培养基、种子培养基和主发酵培养基中。碳源例如为碳氢化合物如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉，以 及有机酸如醋酸和乳酸。碳源可单独加入或者与其它物质组合加入。氮 源例如为有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦汁、玉米浆液和大 豆糖蜜，以及无机氮源诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵和硝酸铵。 氮源可单独加入或者与其它物质组合加入。培养基另外添加有磷酸二氢 钾或者磷酸氢二钾以及与其相应的磷酸钠盐作为磷酸源。金属盐如硫酸 镁或者硫酸铁可加入到培养基中。另外，也可加入氨基酸、维生素和适 当的前体。这样的培养基或者前体可通过分批型或者连续地添加到培养 液中。为了调节培养基的pH，在培养过程中可加入氢氧化钠、氢氧化钾或 者氨水。在培养过程中气泡的产生通过消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑 制。为了保持需氧状态，将氧气或者含氧气体(例如空气)加入到培养 基中。培养基的优选温度为2(TC到45°C，更优选为25到40°C。培养周期取决于L-赖氨酸的产生期间，优选为10小时到160小时。产生上述培养物的方法选自如下组方法中，分批培养、连续培养和 补料培养。补料培养包括补料分批培养和重复补料分批培养，但不局限 于此。本专利技术涉及一种生产L-赖氨酸的发酵工艺，其中活化的棒状杆菌属 菌株如上述被培养。本专利技术发酵工艺中，从培养基中分离L-赖氨酸可通过任何本领域技 术人员已知的现有技术来进行，如离心、膜过滤、离子交换色谱法和结 晶。例如可通过低速离心从培养基中分离L-赖氨酸，或者通过离子交换 色谱法对利用膜消除生物质的上清液进行分离。具体实施方式以下实施例将对本专利技术的实践和优选实施方式进行详细描述。 但是，应当理解，在考虑所公开内容的基础上，本领域技术人员可 在本专利技术的精神和范围内可以进行修改和补充。 实施例1在本专利技术的优选实施例中，研究了吡咯烷酮羧酸(PCA)对棒状杆 菌属菌株活性的影响。将从冻千细胞中分离并测试滴定量的谷氨酸棒状杆菌(在1998年7 月30日保藏，保藏号KFCC 11043，从2008年5月26日开始在布达佩 斯条约下保藏在韩国微生物保存中心，保藏号KCCM 10951P，韩国首尔市西大门区弘济1洞友林大厦361-221)在LB (Luria Bertani)液体培 养基中培养20小时，然后用灭菌盐水洗涤三次。在含PAC浓度分别为 OgZl、 0.1g/l、 0.25g/l、 0.5g/l和l.Og/1的最低培养基中接种上述培养液， 然后在3(TC下以200rpm摇瓶培养20小时。 最低培养基的成分(灭菌前PH为7.0):葡萄糖10g，(NH4)2SO4 2g，KH2P04 l.Og，K2HP04 3.0g，MgS04 '71120 0.5g， FeS04 7H20 10mg， MnS04 5H20 10mg，生物素lOOpg，硫胺 素 HC1 lOOpg，烟酰氨lmg，泛酸钙lmg， CaCl2 2H20 O.lg， Na2B407 *10H2O 80)ig， (NH4)6Mo027 *41120 440^1经，ZnS04 '71120 10pg， CuS04 7H20 300pg ， MnC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸的培养基中进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌菌株的方法。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2005-12-8 10-2005-01201961、一种通过在添加有吡咯烷酮羧酸的培养基中进行种前培养和种子培养以活化棒状杆菌菌株的方法。2、 根据权利要求1的方法，其特征在于，培养基中吡咯烷酮羧酸的 浓度为0.1g/1到5g/1。3、 根据权利要求l的方法，其特征在于，吡咯烷酮羧...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋锡元，辛正焕，辛铉哲，许英涉，徐海昌，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]