本发明专利技术涉及一种与甘油合成有关的甘油－３－磷酸脱氢酶基因ＤｖＧＰＨ１和ＤｖＧＰＤＨ２的ｃＤＮＡ序列及所编码蛋白质的氨基酸序列。本发明专利技术涉及ＤｖＧＰＨ１或ＤｖＧＰＤＨ２基因的表达载体转入酵母ｇｐｄ１Δ细胞中，该酵母细胞在含盐的培养基上表现出耐盐表型，从而证明了这两个基因能够增加酵母细胞内的甘油合成并提高酵母细胞的耐盐能力，同时也证明了这两个基因在通过基因工程手段提高酵母等生物体内的甘油合成量及增强这些生物的耐盐能力方面具有很好的应用价值。本发明专利技术通过缺失ＤｖＧＰＨ１或ＤｖＧＰＤＨ２基因的部分序列，进一步提高了这两个基因产物的甘油－３－磷酸脱氢酶活性和催化合成甘油的能力以及相应酵母转化子的耐盐能力，因此这两个缺失型的基因衍生物在上述应用领域具有更好的应用前景。此外，本发明专利技术证明了ＤｖＧＰＨ１和ＤｖＧＰＤＨ２基因在盐藻体内的表达受盐胁迫的诱导，表明这两个基因是盐藻合成甘油的关键酶，为将这两个基因应用于上述领域进一步提供了理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因及其应用。
技术介绍
世界人口不断增长，预期到2050年结束，世界人口可达到60亿。另一方面，世 界20%的可耕土地严重的盐渍化，严重影响了粮食的产量。粮食作物的供给正受到土 地盐渍化的威胁。理解生物抗盐机制对于利用育种和基因工程的方法改良作物耐盐性 是十分重要的。甘油是重要的轻化工原料，甘油市场供不应求。随着石油能源和可耕土地不断的 减少，化学法生产甘油遭遇瓶颈，产量亦不断减少。化学合成法生产甘油(丙三醇) 的经济效益不断下降。因此发酵法生产甘油的竞争力不断突出。发酵法具有安全性好， 原料丰富易得，设备要求简单的优点。因此利用改良发酵菌株提高甘油产量具有重要 的经济价值。盐藻(D,"fe/to)广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中，尤其在高 盐水域中是主要种群。盐藻是最耐盐的真核生物，具有十分惊人的渗透调节能力，能 在低至50mM高至接近饱和的盐浓度的环境下生存，可以一次性耐受3-4倍的渗透压 变化。盐藻能通过调节细胞内甘油的浓度来维持细胞内外的渗透压平衡以抵抗环境中 的盐胁迫。通常情况下，甘油是盐藻体内唯一的渗透剂。盐藻体内的甘油浓度是随着 细胞外的盐浓度呈正相关变化。当盐藻细胞受到高盐胁迫震荡的瞬间，细胞迅速启动 甘油合成途径合成甘油以维持细胞内外的渗透压的平衡，并在90min内就可以完成调 节。盐藻体内积累大量的甘油，并且在极高的盐浓度(>3.5MNaCl)时，细胞内甘 油的浓度可以高达50%。盐藻甘油代谢途径调控机制的研究是理解盐藻独特的耐盐能力的关键之一。盐藻 甘油合成主要场所是叶绿体。已知盐藻细胞甘油合成途径是磷酸二羟丙酮(DHAP) 催化生成甘油的途径。两个酶参与催化DHAP向甘油的转化，即DHAP首先通过甘 油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)催化转化为甘油-3-磷酸(G3P)， G3P再通过磷酸甘油磷 酸酶(GPP)的催化转化成为甘油。在酵母中的研究证实，GPDH是甘油合成过程中的关键酶。盐藻中研究发现盐藻中甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)同样是控制DHAP转化为甘油的关键酶，并且GPDH 活性是盐藻调控甘油合成途径的靶点。因此克隆分析盐藻中GPDH基因是深入理解 盐藻抗盐机制和高积累甘油能力的关键，同时也会为生物耐盐基因工程和通过发酵法 生产甘油提供重要的基因资源。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因。本专利技术的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本专利技术的目的之三在于提供包含该基因的重组载体。本专利技术的目的之四在于提供包含该基因的转化体。本专利技术的目的之五在于提供该基因在提高甘油合成能力中的应用。本专利技术的目的之六在于提供该基因在提高耐盐能力中的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因具有下列核 苷酸序列之一(1) .具有SEQ N0 1—2所示的DNA序列；(2) .与序列表中序列1-2限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。上述的与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的编码蛋白，其特征在于该编 码蛋白具有序列表中序列3-4的氨基酸残基序列或者是将序列3-4的氨基酸残基序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列3-4的氨基酸残 基序列相同活性的由序列3-4衍生的蛋白质。 一种含有上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的重组载体。 一种含有上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的转化子。 一种上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高甘油合成能力中的应用。一种上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高耐盐能力中的应用。本专利技术首次从盐藻(D^aZ/e/k WnW&)中分离到两个甘油合成的关键基因 DvGPDHl和DvGPDH2，并首次通过转化酵母细胞证明了这两个基因的功能及其在 提高生物体耐盐能力和甘油合成方面的应用价值，这两个基因在基因工程改良和工业 生产甘油中具有很好的应用前景。附图说明图1为本专利技术的甘油-3-磷酸脱氢酶基因DvG尸//7和DvG户D//2的编码蛋白 具有SERB-GPDH双结构域，并且含有保守的叶绿体转移肽。图2为本专利技术的甘油-3-磷酸脱氢酶基因iX7尸//7和Z)vG户Z)//2基因同源性 分析。其中A是GPDH同源基因分析图，B是SERB同源基因分析图。图3为本专利技术的甘油-3-磷酸脱氢酶基因DvG户/W和DvGPD/K基因在酵母 突变体g/^/z/中的功能分析。其中A的功能分析使用了酵母表达载体pAJ401， B的功能分析使用了酵母表达载体pYES2。图4为本专利技术的甘油-3-磷酸脱氢酶基因和DvG户D//2基因在不同 盐胁迫下的表达模式。其中A为盐藻在盐振荡下体内甘油合成的模式，B为稳定 生长在不同盐浓度环境下的盐藻体内DvGP//7和DvGPZ)i/2的表达模式，C为 DvOP//7和Zh;G/lD//2在经盐振荡处理后盐藻体内的表达模式。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本 专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方 法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例一DvC^D/O和DvG户DH2全长编码区的克隆与分析提取盐藻总RNA，反转录cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，通过PCR， 利用引物GPDH15'p禾卩GPDH13'p克隆到DvOPD7W，通过引物GPDH25，p禾口 GPDH23'p克隆到DvOPD//2。为了进一步在酵母中证明这两个基因的功能及应 用(实施例三)，通过引物GPDH15'p和GPDH25'p在基因5'端加入克隆酶点五coi /和真核翻译保守序列Kozak;通过引物GPDH13'p和GPDH23'p在基因3'端加 入克隆酶点^w /。引物序列如下 (1)GPDH15'p (引入五coRI酶切位点和Kozak序歹U):5'-AGAATTCAGCATGGTCCTAGGGTCATCACC-3， 粗体为￡coR I识别位点，下 划线所示为Kozak序列(2) GPDH13'p (引入，ol酶切位点)5，-ATCTCGAGCCAGTGCATGCTCTTTAAATGAC-3，粗体为^ w I识别位点；(3) GPDH25，p (引入￡coR I酶切位点和Kozak序歹!j):5 ， - AG AATTC AC AATGGTTCTC AAGGG AGGGAG-3 ，粗体为￡coR I识别位点，下 划线所示为Kozak序列；(4) GPDH23 'p (引入屈o I酶切位点)5，-ATCTCGAGTGTTCAAATTGCTTAAATGCAC-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与甘油合成有关的甘油－３－磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：（１）．具有ＳＥＱ ＮＯ １－２所示的ＤＮＡ序列；（２）．与序列表中序列１－２限定的核酸序列具有９５％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的ＤＮＡ序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋仁涛，许政暟，何云霞，孟祥宗，张男，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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