一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米ＤＮＡ疫苗，及其制备和应用。所说的空肠弯曲菌壳聚糖纳米ＤＮＡ疫苗，是壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因ｆｌａＡ和真核表达载体ｐＣＡＧＧＳ组成的ｐＣＡＧＧＳ－ｆｌａＡ，所述的鞭毛蛋白ｆｌａＡ基因具有ＳＥＱ　ＮＯ．１所示的核苷酸序列。其是将构建好的重组质粒ＤＮＡ溶于壳聚糖溶液中制得。该疫苗还能用于制备预防鸡空肠弯曲菌的药物。本发明专利技术疫苗经试验表明，可激发产生特异性体液和局部的黏膜免疫应答，口服攻毒后，泄殖腔排菌率呈现显著下降趋势，并能减少血液和小肠、大肠、盲肠中空肠弯曲菌数量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组质粒、纳米-质粒纳米颗粒的制备和应用，特别是涉及一种空肠弯曲菌 壳聚糖纳米DNA疫苗，以及质粒-壳聚糖纳米颗粒制备和应用。技术背景自1990年偶然发现质粒DNA在肌肉细胞中能进行转化和表达，并推测用DNA注入机 体可能产生免疫反应以来，全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。DNA疫苗能诱 导机体产生体液免疫和细胞免疫，兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性，可以非 常容易操作质粒DNA以改变免疫反应的质和量，并具有简单、经济、易于储存运输等优点， 被认为是第三代疫苗。1995年5月，报导了世界第一例DNA疫苗的临床试验，世界卫生组 织(WHO)把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。DNA疫苗虽然有诸多优点，但也有许多需要优化的地方。如核酸疫苗的免疫剂量问题 仍然困扰着人们；DNA疫苗免疫原性弱，不如一般传统疫苗和减毒活疫苗引起的免疫反应 强等，成为阻止DNA疫苗应用于临床的障碍。如何提高DNA疫苗的免疫原性，尤其是在 人和动物体内诱导免疫反应的能力，在很大程度上决定着DNA疫苗未来的命运。DNA疫苗新技术的核心之一是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的 真核表达载体中构建核酸疫苗，然后将其导入动物体内，重组的核酸疫苗可以利用动物体内 的酶系合成外源基因编码的蛋白，从而诱发动物对该外源蛋白产生免疫应答，达到免疫目的。DNA疫苗的免疫效果是由质粒、佐剂的使用、免疫方案以及免疫接种的操作技术等因 素决定的。质粒的因素又包括载体和抗原基因两个方面， 一般认为，免疫反应的强度与质粒 转染效果和基因表达效率两个因素正相关。不同的疾病对保护性免疫有着不同的要求，是以 体液免疫为主还是以细胞免疫为主，增强DNA疫苗免疫效应的策略必须反映这些要求。为了解决DNA疫苗免疫原性弱的问题，许多科学家正致力于研究提高DNA疫苗免疫 原性的方法，其中一个重要的方面就是改进载体以提高抗原的表达，提高载体的耙向性和研 究更高效的辅助分子包括细胞因子及其他免疫佐剂。壳聚糖微囊是一种具有广阔前景的新型药物载体，具有无毒、生物相容性高、生物可降 解、可控制药物的释放、提高药物生物利用度以及增加药物局部滞留性等优点。1995年， Munper等人首次报道壳聚糖溶液与DNA以自聚集的方式沉淀能得到一种大小为150~500 nm的复合物，初步认为壳聚糖有用于基因治疗载体的潜质。近年来，许多研究表明壳聚糖 能和DNA形成微囊，可以用做基因转运系统来转运治疗性基因和基因疫苗。Roy等人的研 究证明壳聚糖-DNA纳米微囊系统能有效地在小鼠小肠释放DNA，诱发有效的粘膜免疫保护 反应。因此，壳聚糖是发展DNA疫苗的一个有广阔应用前景的介质。空肠弯曲菌是G—菌，是引起人肠炎的首要病原菌，与人神经炎病变关系密切。空肠弯 曲菌能定殖于大多数温血动物的肠黏膜，几乎包括所有的食物源性动物和人类，尤其是在野 鸟、雏鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和驼鸟等几乎所有禽的肠道，而且空肠弯曲菌在禽肠道的定殖是 共栖关系，禽肉加工过程中交叉污染，并通过食物链感染人是公认的途径。减少/消灭食品 链尤其是禽类中空肠弯曲菌是控制该菌的主要策略，控制或清除禽类弯曲菌是预防和控制人 空肠弯曲菌病的重要前提。多种措施被应用于减少禽的污染率，包括通过采取生物安全措施、建立健康动物群和提 高净化饲养环境卫生等，另外，很多实验性研究也相继开展，如肠道菌群的竞争性抑制、抗 菌性微生物或抗生素治疗等，尽管这些方法很有效，但存在耐药性等很多缺点。疫苗仍被认 为是控制和减少禽弯曲菌最有效、安全的方法，由于空肠弯曲菌生态和生理特征，包括灭活 苗在内的多种常规疫苗对控制鸡空肠弯曲菌的作用较差，不能满足国内外养禽业对高效、安 全可靠、有预防作用的鸡空肠弯曲菌疫苗的迫切需求。分子生物学和疫苗设计的发展为鸡空 肠弯曲菌防治提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有传统接种空肠弯曲菌灭活菌或裸DNA疫苗作为预防疫苗，产 生的抗体滴度低、免疫效果差、易产生免疫逃避、仅有较弱的预防作用等缺陷，从而提供一 种能有效降低鸡体内空肠弯曲菌携带量的壳聚糖纳米DNA疫苗。本专利技术的另一 目的是提供该壳聚糖纳米DNA疫苗的制备。本专利技术的再一 目的是提供该壳聚糖纳米DNA疫苗的用途。本专利技术的目的是由如下的技术方案实现的 一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗，是 壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，其中，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因_/7o4和真核表达载体pCAGGS组成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白基因具有SEQ NO.l所示的核苷酸序列。前述的鞭毛蛋白_/7^基因是空肠弯曲菌的致病决定基因，其为弯 曲菌基因组的核苷酸，应用现代纳米技术研制而成壳聚糖-重组的纳米颗粒，用做基因转运 系统来转运基因疫苗。本专利技术提供的所述空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗的制备，包括如下步骤1) 设计特异性引物根据GenBank登陆序列(gi:30407139)，利用DNAstar软件分析，选取空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因y/^4的核苷酸序列，按正确的阅读顺序设计一对引物上游引物FlaA-F 5'-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3' Q^a I ) 下游引物FlaA-R 5'-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3' (￡coR I )2) 通过PCR技术扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白^a4基因，克隆、回收得到纯化的y c^基 因片段；3) 将_/7"基因重组到质粒pCAGGS真核表达质粒中，构建成重组质粒pCAGGS-flaA;4) 将构建好的重组质粒pCAGGS-flaA溶于壳聚糖溶液中，制成一种空肠弯曲菌壳聚糖 纳米DNA疫苗。本专利技术进一步提供了空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗在制备用于预防鸡空肠弯曲菌的 药物中的应用。本专利技术提供的空肠弯曲菌壳聚糖纳米DNA疫苗优益之处在于1)所需的免疫量较小， 50-100微克即可；2)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫；3) 口服攻毒后，泄殖 腔排菌率呈现显著下降趋势，并能减少血液和小肠、大肠、盲肠中空肠弯曲菌数量；4)免疫过程安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。附图说明图l重组质粒pCAGGS-flaA的构建示意2壳聚糖/质粒纳米颗粒的电泳检测，其中M. DNA Marker, 1. CS-pCAGGS- flaA， 2. pCAGGS- flaA图3壳聚糖-质粒纳米颗粒的电镜观察(X46 000)具体实施方式本专利技术实施中使用的白莱航鸡(WhiteLeghorn)非免疫蛋(受精)购自扬州大学比较医学中心，置孵化箱中自行孵化，去除弱雏、病雏等不健康鸡，备用。 空肠弯曲菌(ATCC33560，购自天恒科技有限公司) pGEM您T easy vector:(购自上海生工生物工程技术服务有限公司) 真核表达载体pCAGGS: (Miyazaki.馈赠，见参考文献) 大肠杆菌DH5 a感受态细胞(购自上海生工生物工程技术服务有限公司) COS-7细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)实施例1.本专利技术的空肠弯曲菌DNA疫苗—pCAGGS-flaADNA疫苗的构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种空肠弯曲菌壳聚糖纳米ＤＮＡ疫苗，是壳聚糖和重组质粒构成的纳米微囊，其特征在于，所说的重组质粒是由空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因ｆｌａＡ和真核表达载体ｐＣＡＧＧＳ组成的ｐＣＡＧＧＳ－ｆｌａＡ，所述的鞭毛蛋白ｆｌａＡ基因具有ＳＥＱ　ＮＯ．１所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，黄金林，尹衍新，李求春，张弓，潘志明，孙林，陈祥，殷月兰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]