农杆菌介导的小对叶遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。本发明专利技术所公开的农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤：以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、ＯＤ↓［６００］值为０．４－０．６的目的农杆菌菌液侵染所述外植体５－１０分钟；所述目的农杆菌菌液的ＯＤ↓［６００］值优选为０．５，所述侵染的时间优选为７分钟。用本发明专利技术方法对小对叶进行遗传转化，得到的抗性芽率为７．５％，表明本方法转化效率高。因此，本发明专利技术方法为使外源基因在小对叶中稳定表达奠定了基础，对小对叶的遗传改良有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
小对叶0feco/7s历o/ /w'eW)是玄参科假马齿苋属多年生沉水草本植物，不仅具有较高的观赏价值，而且还兼有药用之功能。它的自然繁殖系数很低，采用常规方 法很难形成规模化的生产。目前主要对小对叶采用组织培养方法，通过叶片进行增 殖，在短期内得到大量试管苗，既填补了这一领域的空白，又具有一定的经济价值 和药用价值。随着小对叶养殖规模的扩大，迫切需要培育出优良的新品系，以提高 产量和品质。因此,培育出抗逆、优质的小对叶新品种成为亟需解决的问题。目前，基因工程方法是最有效、最快捷、最可靠的新品种培育方法。因此，利 用基因工程技术研究小对叶的生物学特性，培育小对叶的新品种成为必然的发展方 向。随着组织培养技术、基因重组技术的发展，植物转基因技术得到日益广泛的应 用。这无论对于分子遗传学研究或是遗传改良都具有特别重要的意义。自从19S4 年首次获得转基因烟草以来，植物遗传转化技术迅速发展，目前已经建立了多种遗 传转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、 电激转化法、PEG介导法、显微注射法等。其中根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法是目前研究最多、理论机制最清楚、技术方法最成熟的遗传 转化方法。在己获得的近200种转基因植物中约80%是由农杆菌介导法完成的。这 一方法的遗传转化率受农杆菌菌株类型、浸染时间、共培养时间、外植体预培养时 间等因素的影响。目前，根癌农杆菌介导法的小对叶遗传转化研究还未见报道。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是源于海洋生物多管水母属 (Aequoria Victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外 光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达。GFP的荧光反应不需要任何底物 及辅助因子，使表达检测非常简单。同时，GFP在细胞中呈自主表达，没有细胞种 类、位置和种属的特异性。GFP对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，因而可 以很方便的对活体进行观察，来研究GFP基因的表达。由于GFP对光漂白、氧化 剂、还原剂、酸、碱以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性，因此，GFP可作为报告基因来监测转基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。 本专利技术所提供的一种，包括如下步骤以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、OD6。。值为0.4-0.6的目的农杆菌菌液 侵染所述外植体5-10分钟；所述目的农杆菌菌液的OD柳值优选为0. 5，所述侵染的 时间优选为7分钟。所述方法中还包括在所述侵染之前，对外植体进行预培养的步骤，所述预培养 的时间可为1-3天，优选为2天。所述方法中还包括在所述侵染之后进行共培养的步骤，所述共培养的时间可为 4-6天，优选为4天。所述方法中还包括在所述共培养之后进行脱菌培养的步骤，所述脱菌培养中所 用的培养基可含有450mg/L的头孢霉素。所述目的农杆菌含有潮霉素抗性基因。所述方法中在所述脱菌培养后还包括筛选培养的步骤，所述筛选培养的方法包 括如下步骤将所述脱菌培养后的外植体转入含有10mg/L潮霉素的分化培养基中 进行培养，分化得到芽。所述筛选培养方法中还包括如下步骤将所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉 素的生根培养基进行培养。所述目的农杆菌菌液中可含有100mg/L乙酰丁香酮。所述共培养的培养基中也可含有100mg/L乙酰丁香酮。用本专利技术方法对小对叶进行遗传转化，得到的抗性芽率为7.5%，表明本方法转 化效率高。本专利技术中以水生植物小对叶为实验材料，以报告基因——绿色荧光蛋白 基因(green fluorescent protein, GFP)来检测外来基因能否在其中稳定和瞬间表 达，为今后建立小对叶遗传转化系统，使外源基因在其中稳定表达奠定了基础，对 小对叶的遗传改良有十分重要的意义。另外，绿色荧光蛋白基因的转入，还可以提 高小对叶的观赏价值，既美化了环境，又为后续净化水体的研究奠定了基础。 附图说明图1为头孢霉素Cef对小对叶愈伤组织诱导的影响。 图2为卡那霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。图3为潮霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。 图4为小对叶离体叶片分化率与抗生素浓度的回归关系。 图5为转基因植株的总DNA提取。 图6为GUS基因PCR扩增分析。 图7为GFP基因PCR扩增分析。 具体实施例方式下述实施例中主要化学试剂为-GUS基因和GFP基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；rragDNA polymerase、 IPTG、 X-gal、 dNTP (宝生物工程大连有限公司)；琼脂糖(Promega公司)；卡那霉素(Ka画ycin， Km) (Amresco公司)；潮霄素(Hygromycin， Hy) (Roche公司)；壮观霉素(Spectacular adriamycin) (Sigma公司)；氯霉素(Chloramphenicol) (Amresco公司)；组织培养及其它所用化学试剂均为国产或进口分析纯。下述实施例中主要仪器设备为-低温冷冻离心机(BECKMAN ALLegra 21R，美国)；紫外分光光度仪(UNICAM HE入I0S，英国)；PCR扩增仪(PTC-100, MJ Rearch，美国);紫外检测仪(STS—20.WM);凝胶成像分析系统(DC120 EDAS KODAK,美国)；电泳仪(IIOO—型，DYY-A型，DYY-III型，国产);各种玻璃仪器(培养皿、三角瓶、玻璃刮铲等)摇床(HZS—H，国产)；微量移液器(Gilson，法国)；电热手提式蒸汽压力锅(YXQ， SG46' 280型，国产)； 超净工作台(SW-CJ-2FD双人单面净化工作台；国产) 培养箱(DHP-9162型;国产)。 下述实施例中用到的溶液和培养基的组成如下1、配卡那霉素(kan)、潮霉素(Hyg):用灭菌蒸馏水配制浓度为50mg/ml的母液，经0.22Mm滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20。C保存备用。2、 配头孢霉素(Cef):用灭菌蒸馏水配制浓度为250mg/ml的母液，经0. 22Mni 滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20C保存备用。3、 配乙酰丁香酮(AS):先用少量甲醇溶解，后用灭菌蒸馏水配制浓度50mg/ml 的母液，经0.22Mm滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20C保存备用。4、 配利福平(Rif):用灭菌蒸馏水配制浓度为50mg/ml的母液，经0. 22Hm滤 膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20°0保存备用。5、 YEB培养基其组成和含量为蛋白胨5g/1，酵母粉lg/1，牛肉膏5g/1， 蔗糖5g/l， MgS04，7H20 0. 493g/l，其余为水。pH值7.0， 121。C高压灭菌20min。YEB固体培养基中加0. 8%琼脂，YEB液体培养基不加琼脂。6、 MS培养基其组成及含量如表l所示，培养基中附含30gl—'蔗糖和6gl一1 琼脂，PH5.6，液体MS培养基中不加琼脂，120C高压灭菌20rain。表l、 MS培养基<table>ta本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤：以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、ＯＤ↓［６００］值为０．４－０．６的目的农杆菌菌液侵染所述外植体５－１０分钟；所述目的农杆菌菌液的ＯＤ↓［６００］值优选为０．５，所述侵染的时间优选为７分钟。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓萍，吴丽爽，关旸，郭东林，郭长虹，
申请(专利权)人：哈尔滨师范大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]