本发明专利技术属于奶牛分子生物学技术研究领域，具体涉及奶牛总ＤＮＡ制备技术领域。公开了一种从牛奶中提取总ＤＮＡ的方法。针对奶牛属于经济性动物，为了避免因采血和采取活体奶牛组织而引起的应激，克服提取奶样总ＤＮＡ含有较高的蛋白质污染障碍等问题，提出了更方便的获取ＤＮＡ来源，研制出从纯化奶样体细胞到提取高质量ＤＮＡ的关键技术，通过实验制备出纯化奶样体细胞的试剂和提取ＤＮＡ的裂解混合液，之后先用不同酒精浓度梯度洗涤，再用酚法抽提去除蛋白质和多糖等其他物质，最后用无水乙醇洗涤，晾干后溶于ＴＥ。本发明专利技术采样简单方便，抽提的总ＤＮＡ样品质量较高；本方法经济、稳定、方便，为奶牛的分子生物学的应用提供了新的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及奶牛分子生物学
具体涉及从牛奶样品中纯化体细胞与抽提总DNA的方法。
技术介绍
获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础,寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学 实验所面临的第一个问题，目前使用无应激方法获得奶牛DNA是研究者面临的一个重要问题，尤其表现在 动物福利方面，主要原因是由于采取血样会造成应激反应，降低奶牛生产性能。当前从奶牛个体获得基因 组DNA的样本来源主要有血液、肌肉组织、脏器组织、精液等，这几个样本来源使用常规的提取方法， 提取的效果较好。目前利用牛奶作为高质量DNA提取来源，存在技术匮乏问题。当前利用奶样作为来源提 取DNA的方法主要有盐析法(田雨，从牛奶中分离DNA方法的建立；乳业科学2006， 3:112-113。 F. d'Angelo， A. Santillo, A. Sevi, and M. Albenzio(2007)采用盐析法提取羊奶总DNA(A Simple Salting-Out Method for DNA Extraction from Milk Somatic Cells: Investigation into the Goat 基因.J. DairySci. 90:3550 - 3552).)和SDS/酚法(E. LIPKIN， ANNE SHAL0 M， H. KHATIB, M. SOLLER， and A. FRIEDMANN(1993).Milk as a Source of Deoxyribonucleic Acid and as a Substrate for the Polymerase Chain Reaction. J Dairy Sci 76:2025-2032),都是先得到体细胞，然后再用相应的试剂消化抽提。就目 前的技术，得到的奶样DNA在纯度和浓度都相对较低，闪此更加需要改进方法，已达到获得较好的奶样DNA 样品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种从牛奶中抽提总DNA的方法，以达到快速、经济、 方便的效果，适用于奶牛分子生物学的技术操作。 本专利技术通过以下技术方案实现—种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤 1、 一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤1) 采样前准备用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之 后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样；2) 采样预先在离心管中加入lral体细胞闹定液和2(m重铬酸钾0.5ral作为防腐剂，将采取的奶样装 入离心管至50ml，于2500转/分，4X:离心30分钟3) 弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lml灭菌磷酸缓冲液， 将底部沉淀捶打悬浮并转移至1. 5ral的离心管中，在3500转/分，常温(20-下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀4) 向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟5) 离心后将上清弃去，加乳化剂150ixl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350wl，用振荡器振荡至沉淀完全 悬浮，401C恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；6) 水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液lral悬浮沉淀，将混合液 转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20X:冻存，或者 直接将所述的体细胞进行DNA提取；7) 向步骤6)存有体细胞的l. 5ml离心管中加入裂解混合液I 600u l和裂解混合液II150u 1,振荡使其 底部沉淀至完全悬浮，置于56"C水浴锅过夜消化，得到消化产物；8) 对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别 加M的95%、 75%、 70%乙酵进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙酵，在常温T^发乙醇5分钟，得到DNA 粗品；9) 将步骤8)得到的DNA粗品加500 u 1去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8. 0的Tris 饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温卜'离心10分钟，得到上清液10) 将步骤9)的上清液转移到另一个1. 5ml离心管中，来冋颠倒10分钟，按体积比为25: 24: 1加 入两倍体积的酚氣仿异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液11) 将步骤10)的上清液转移到另一个1. 5ml离心管中，按体积比为24: 1加入两倍体积氯仿异戊 醇，来冋颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；12) 将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3 M/L ， pH为5. 2的NaAc 及2倍体积的预冷过的无水乙醇，来回摇晃离心管，丁一20"C放置30分钟；再于12000转/分，25"下离 心10分钟，小心倒掉上层无水乙醇，得到DNA闩色沉淀；13) 加入70%的乙醇lml,洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小 心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100 nl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA/TE)过夜溶解DNA, 得到DNA纯品； 其中，步骤2)所述的体细胞固定液配制如下将35-40%甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中； 步骤5)所述的乳化剂配制如下在1L乳化剂中90%的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x 100) 20ml， 95%乙醉125ml， 0.9g/lNaCl 溶液肪5ml:步骤7)所述的裂解混合液I配制如下混合液I:隨1M/L， Tris-Cl 0. 5M/L， EDTA-Na 0. 5M/L,调pH至7.5-8.0:步骤7)所述的裂解混合液n配制如下20%十二烷基硫酸钠40 w 1 ， 20mg/ml的蛋白酶K 20 u 1，乳化剂90 u 1; 步驟13)所述的Tris-EDTA/TE溶液配制如下分别取pH为8. 0的1M/L Tris-Cl 2 ml和0. 5M/L EDTA 0.4ml ,将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水 定容至200ml,调pH至8.0。步骤3)、 4)、 5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下分别称取NaCl 8g , KCL 0. 2g， N&HPOh 1. 44g, 肌POi 0. 24g，将各种物质溶解于800ml蒸馏水中， 调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。2、《
技术实现思路
》l中所用的牛奶样品是加防腐剂后24小时以内的奶样。本专利技术的有益效果是本专利技术对现有技术的贡献主要体现在以下方面本专利技术在体细胞纯化中加入体细胞固定液、防腐剂和乳化剂，体细胞固定液有效地使乳中的体细胞固 定在乳液中，防腐剂可以解决天气炎热时期样品的短时间(24小时内)保存，乳化剂使离心后体细胞周围的乳脂经过40X:恒温5-10分钟而脱去。尽管奶中的体细胞经过纯化，但是其细胞膜周围还有带有其他物质，因此在裂解细胞时，再次添加乳 化剂去除体细胞周围乳脂，提高裂解液部分试剂的浓度和使用莆，使体细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从牛奶中提取总ＤＮＡ的方法，其特征在于以下步骤： １）采样前准备：用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前２－３把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样； ２）采样：预先在离心管中加入１ｍｌ体细胞固定液和２０％重铬酸钾０．５ｍｌ作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至５０ｍｌ，于２５００转／分，４℃离心３０分钟； ３）弃去步骤２）离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加１ｍｌ灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至１．５ｍｌ的离心管中，在３５００转／分，常温下离心１０分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀； ４）向步骤３）的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液１ｍｌ，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在１０００转／分，常温下离心１０分钟； ５）离心后将上清弃去，加乳化剂１５０μｌ，再加灭菌的磷酸缓冲液１３５０μｌ，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，４０℃恒温水浴处理５－１０分钟脱去体细胞周围的乳脂； ６）水浴后，在３５００转／分，常温下离心１０分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液１ｍｌ悬浮沉淀，将混合液转移至１．５ｍｌ的离心管中，于１２０００转／分离心１０分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置－２０℃冻存，或者直接将所述的体细胞进行ＤＮＡ提取； ７）向步骤６）存有体细胞的１．５ｍｌ离心管中加入裂解混合液Ⅰ ６００μｌ和裂解混合液Ⅱ １５０μｌ，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于５６℃水浴锅过夜消化，得到消化产物； ８）对步骤７）的消化产物加入等体积的无水乙醇，１２０００转／分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加１ｍｌ的９５％、７５％、７０％乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇５分钟，得到ＤＮＡ粗品； ９）将步骤８）得到的ＤＮＡ粗品加５００μｌ去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的ｐＨ为８．０的Ｔｒｉｓ饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒１０分钟，１２０００转／分，常温下离心１０分钟，得到上清液； １０）将步骤９）的上清液转移到另一个１．５ｍｌ离心管中，来回颠倒１０分钟，按体积比为２５∶２４∶１加入两倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇，在１２０００转／分，抽提１０分钟，得到上清液； １１）将步骤１０）的上清液转移到另一个１．５ｍｌ离心管中，按体积比为２４∶１加入两倍体积氯仿∶异戊醇，来回颠倒１０分钟，１２０００转／分，抽提１０分钟，得到上清液； １２）将步骤１１）的上清液转移到另一个１．...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张军伟，易建明，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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