微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法，LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。本发明专利技术的技术(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增无需PCR仪等特殊设备；(2)检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内。(3)高特异性：检测引物组的特异性引物，只能有效扩增微小脲原体，不能有效扩增解脲脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体。(4)高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝。(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。

【技术实现步骤摘要】
微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及微小脲原体的快速检测，具体是一种微小脲原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
支原体是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，包括支原体和脲原体等多种类型，因为缺乏细胞壁而对青霉素、头孢类等抗生素天然耐药。脲原体中的解脲脲原体与微小脲原体旧时统称为解脲支原体，均能够引起人类疾病和导致实验室细胞污染，但两者所致感染的类型和具体临床表现却有所差异。微小脲原体和解脲脲原体是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，两者均可引起男性的非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎和女性的子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等疾病。目前微小脲原体检测的方法主要有培养法、免疫法和PCR法等，其中培养法的特异性和敏感性都很好，但该方法所耗费的时间却较长，通常需要48h才能出结果。免疫法虽然操作简便和耗时较少，但其特异性和敏感性却不高。PCR法的敏感性很高，而且检测所需的时间也很短，但目前常用的PCR法却存在依赖特殊设备和不能实现POCT等不足。尤为重要的是，此前绝大多数微小脲原体核酸扩增方法都以mba基因、ure基因、16SrRNA基因或16S-23SrRNA间隔序列作为靶序列，由于上述核酸序列在各种脲原体(特别是微小脲原体和解脲脲原体)之间差异较小或同种脲原体临床株间多态性较大，因此该类方法通常需要采用多重引物或多次试验才能准确地检测临床标本中的微小脲原体。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是本世纪初问世的一种新的核酸扩增技术，该技术进行核酸扩增时无需变换温度，在等温条件下即可完成整个扩增反应，而且最终的结果判断可通过肉眼观察颜色变化即可实现，因此LAMP不需要能够精确控温和进行荧光监测的PCR仪等特殊设备。因为LAMP能够弥补PCR法某些方面的不足，所以该技术在水产病害检测、动物源性检测、转基因农产品检测、公共卫生检疫检测和医学病原体检测等众多领域得到了应用，但目前在微小脲原体检测方面LAMP尚未得到应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微小脲原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种微小脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：外引物F3:5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’；外引物B3:5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’；内引物FIP:5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGGAAGGAA-3’；内引物BIP:5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTGTT-3’；环引物LF:5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’；环引物LB:5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’。作为上述LAMP检测引物组的进一步改进，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。一种微小脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、BstDNA聚合酶、指示剂、密封液，引物为上述的LAMP检测引物组。作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱。作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，指示剂为荧光染料或显色剂。作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，荧光染料为SYBRgreen，显色剂为羟基萘酚蓝。作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，BstDNA聚合酶的终浓度为6～10U/μL。作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，外引物、内引物和环引物的初始浓度均为10μM。一种微小脲原体LAMP检测试剂盒检测微小脲原体的方法，包括如下步骤：1)提取待检样品DNA；2)使用权利要求3～9任一项所述的LAMP检测试剂盒扩增样品DNA，反应条件为63℃等温反应60min进行扩增，然后90℃等温反应2min终止反应；3)根据指示剂的指示情况，判断结果；该方法不用于疾病的诊断。本专利技术的有益效果是：(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增无需PCR仪等特殊设备；(2)检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内。(3)高特异性：检测引物组包括六条特异性引物，只能有效扩增微小脲原体，不能有效扩增解脲脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体。(4)高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝。(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。附图说明图1是靶基因特异性扩增电泳图；图2是特异性分析荧光曲线图；图3是特异性分析肉眼观察图；图4是灵敏性分析荧光曲线图；图5是灵敏性分析肉眼观察图；图6是临床标本检测荧光曲线图；图7是临床标本检测肉眼观察图。具体实施方式下面结合实施例，进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员需要理解的是，所描述的实例只是本专利技术的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为对本专利技术的限制。基于本专利技术中的实施例，在无创造性劳动前提下对本专利技术方法、步骤或条件的修改或替换，都属于本专利技术保护的范围。引物设计专利技术人通过查询并使用独有方法优化，得到针对微小脲原体特有核酸序列UP063的LAMP引物组如下：外引物F3:5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’(SEQIDNO：1)；外引物B3:5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’(SEQIDNO：2)；内引物FIP:5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGGAAGGAA-3’(SEQIDNO：3)；内引物BIP:5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTGTT-3’(SEQIDNO：4)；环引物LF:5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’(SEQIDNO：5)；环引物LB:5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’(SEQIDNO：6)。常规方法设计的引物作为对比，用于验证微小脲原体特有基因序列的比较试验包括以下扩增引物：063F：5’-TGCGGTGTTTGTGAACT-3’(SEQIDNO：7)；063R：5’-TGATCAAACTGATATCGCAATTATAGA-3’(SEQIDNO：8)；UPF：5’-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3’(SEQIDNO：9)；UPR：5’-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3’(SEQIDNO：10)；应用上述两对引物分别检测微小脲原体、解脲脲原体和人型支原体等支原体临床株的两种靶基因(即UP063和mba基因)，比较两种靶基因扩增阳性结果并分析其正确率，正确率越高，表示该靶基因扩增检测微小脲原体的特异性越高，也表明该靶基因更适合被用于临床标本中微小脲原体的检测。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微小脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：外引物F3:5’‑GCTGGTCCTTTATTCACCTTA‑3’；外引物B3:5’‑GGCAATGTGATAATATGGCCCC‑3’；内引物FIP:5’‑GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGG AAGGAA‑3’；内引物BIP:5’‑TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTG TT‑3’；环引物LF:5’‑AATTGCGATATCAGTTTGATC‑3’；环引物LB:5’‑AATACTGATTGAAGAGTTCACA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种微小脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：外引物F3:5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’；外引物B3:5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’；内引物FIP:5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGGAAGGAA-3’；内引物BIP:5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTGTT-3’；环引物LF:5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’；环引物LB:5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’。2.根据权利要求1所述的LAMP检测引物组，其特征在于：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。3.一种微小脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、BstDNA聚合酶、指示剂、密封液，其特征在于：引物为权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡慧娜，
申请(专利权)人：蔡慧娜，
类型：发明
国别省市：广东,44