检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体及检测方法。本发明专利技术所提供的检测AFB1的凝血酶联核酸适配体是标记了凝血酶的既能够特异性结合AFB1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体A，所述核酸适配体A由能够与AFB1特异性结合的核酸适配体A1(序列8所示的单链DNA)和能够与凝血酶特异性结合的核酸适配体A2(序列7所示的单链DNA)连接而成。本发明专利技术的核酸适配体可利用凝血酶的不同类型的底物分子分别建立用于检测AFB1的荧光检测法和吸光光度法。本发明专利技术的方法具有易操作、灵敏度高等特点。本发明专利技术利用凝血酶联核酸适配体法实现了对AFB1的灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体及检测方法
本专利技术属于分析检测领域，涉及一种检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体及检测方法。
技术介绍
黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)是一种毒性很强的真菌毒素，被摄入体内可以导致癌症。AFB1的灵敏检测在食品安全、环境健康、质量监控等领域具有重要意义。目前常用的定量分析AFB1的方法，主要包括色谱法和免疫分析法等。色谱法往往需要昂贵复杂的仪器设备，往往需要与荧光检测器或质谱检测器联用，测试成本高。免疫分析则需要采用针对AFB1的免疫抗体，用于选择性分析AFB1，构建分析传感方法，但是免疫抗体在制备和稳定性等方面存在局限性，制备费用高，不便于储存和运输，容易变性。核酸适配体(Aptamer)是从随机的寡聚核苷酸文库中筛选得到可以与目标分子特异结合的单链核酸分子。核酸适配体是一种新型的亲和配体，具有很多优点，例如筛选制备相对简单容易，制备成本低，容易引入功能团，具有较高的热稳定性等。核酸适配体的序列已知后，可以通过化学合成的方法制备，纯度高，批间重现性好，而且热稳定性好。核酸适配体在分析传感、疾病治疗等领域具有很大的应用潜力。黄曲霉毒素B1的核酸适配体已经被成功筛选得到，因此采用黄曲霉毒素B1的核酸适配体发展检测方法也成为可能。凝血酶(thrombin)分子是血液中一种重要的酶分子，可以特异性地水解特定序列的多肽分子。利用凝血酶的核酸适配体可以特异性的捕获凝血酶，并进行分析检测。凝血酶分子可以催化水解特定的多肽小分子底物分子产生相应的信号变化。凝血酶分子具有很好的催化活性，而且容易获得。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体、试剂盒及检测方法。本专利技术首先提供了一种既能够特异性结合黄曲霉毒素B1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体A。所述核酸适配体A由能够与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配体A1和能够与凝血酶特异性结合的核酸适配体A2连接而成。所述核酸适配体A1为序列表中序列8所示的单链DNA；所述核酸适配体A2为序列表中序列7所示的单链DNA。其中，所述连接可为直接首尾相连或者通过linker首尾相连；所述linker为3-6个核苷酸T，具体如3个T或者6个T。所述直接首尾相连可为所述核酸适配体A1的3’末端与所述核酸适配体A2的5’末端直接相连，或者所述核酸适配体A2的3’末端与所述核酸适配体A1的5’末端直接相连。相应的，所述通过linker首尾相连可为通过所述linker将所述核酸适配体A1的3’末端与所述核酸适配体A2的5’末端相连，或者通过所述linker将所述核酸适配体A2的3’末端与所述核酸适配体A1的5’末端相连。更加具体的，在本专利技术中，所述核酸适配体A为如下任一：(a1)序列表中序列1所示的单链DNA；(a2)序列表中序列2所示的单链DNA；(a3)序列表中序列3所示的单链DNA；(a4)序列表中序列4所示的单链DNA；(a5)序列表中序列5所示的单链DNA；(a6)序列表中序列6所示的单链DNA。本专利技术所提供的用于检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体，具体是将凝血酶与前文所述的核酸适配体A特异性结合后制得的。本专利技术所提供的用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其中含有经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板和如下(b1)或(b2)：(b1)前文所述的核酸适配体A和凝血酶；(b2)前文所述的凝血酶联核酸适配体。其中，所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将含有BSA-AFB1偶联物(SigmaAldrich公司，产品编号为A6655)的0.1MNa2CO3溶液(pH9.6)加入到微孔板(吸光光度检测法所采用的微孔板为透明的96孔板。荧光检测法所采用的微孔板为黑色的96孔板)的板孔中，4℃下温育12小时，然后经洗涤、封闭制得所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板。更加详细的步骤可参见实施例2。所述核酸适配体A或所述凝血酶联核酸适配体或所述试剂盒在检测黄曲霉毒素B1中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所提供的检测黄曲霉毒素B1的方法，其原理如下：牛血清白蛋白(BSA)-AFB1偶联物(BSA-AFB1)被修饰到微孔板的微孔表面，从而将AFB1修饰到微孔板的基底上。溶液中待测的AFB1分子与固定在微孔板上的AFB1分子与凝血酶标记的核酸适配体探针竞争性地结合。当待测溶液中不存在AFB1时，凝血酶标记的核酸适配体探针只与微孔板基底上的AFB1结合，凝血酶被修饰到微孔板的基底上。随着待测溶液中AFB1的增多，修饰到微孔板上的凝血酶分子逐渐减少。修饰保留在微孔板基底上的凝血酶选择性催化水解特定的多肽底物生成产物，产生检测信号。根据所用的底物不同，可以产生相应的荧光信号或吸光度信号。根据检测信号的变化可以实现对AFB1的检测。所述检测黄曲霉毒素B1的方法，具体为方法I或方法II：所述方法I为荧光检测法，具体可包括如下步骤：(c1)将前文所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液。(c2)将所述混合液加入到经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清。(c3)向所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的荧光多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后测定荧光信号的强度值，从而实现对所述待测溶液中黄曲霉毒素B1的检测(既可为定量检测，也可为定性检测)。所述方法II为吸光光度检测法，具体可包括如下步骤：(d1)将前文所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液。(d2)将所述混合液加入到经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清。(d3)向所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的生色多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后测定吸光度值，从而实现对所述待测溶液中黄曲霉毒素B1的检测(既可为定量检测，也可为定性检测)。在步骤(c2)和(d2)中，进行所述温育的条件均可为4℃温育30分钟。在步骤(c3)和(d3)中，进行所述酶反应的条件均可为37℃反应2小时。在步骤(c2)和(c3)之间，以及步骤(d2)和(d3)之间，还包括洗涤的步骤。在所述方法I中，当为定量检测时，步骤(c3)具体可按照如下确定所述待测溶液中黄曲霉毒素B1的含量：当所述酶反应结束后，将所测定的荧光信号的强度值代入标准曲线方程，从而计算所述待测溶液中黄曲霉毒素B1的含量；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液替代所述待测溶液进行步骤(c1)-(c3)，测得各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液对应的荧光信号的强度值，从而获得黄曲霉毒素B1的浓度与荧光信号的强度值之间的标准曲线方程。当为定性检测时，步骤(c3)具体可按照如下确定所述待测溶液中是否含有黄曲霉毒素B1：当所述酶反应结束后，若所测定的荧光信号的强度值显著低于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有黄曲霉毒素B1；反之，则所述待测溶液中不含有或候选不含有黄曲霉毒素B1。其中，所述对照值为用不含有黄曲霉毒素B1的溶液替代所述待测溶液进行步骤(c1)-(c3)所测得的荧光信号的强度值。在所述方法II中，当为定量检测时，步骤(d3)具体可按照如下确定所述待测溶液中黄曲霉毒素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种既能够特异性结合黄曲霉毒素B1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体A，由能够与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配体A1和能够与凝血酶特异性结合的核酸适配体A2连接而成；所述核酸适配体A1为序列表中序列8所示的单链DNA；所述核酸适配体A2为序列表中序列7所示的单链DNA。

【技术特征摘要】
1.一种既能够特异性结合黄曲霉毒素B1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体A，由能够与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配体A1和能够与凝血酶特异性结合的核酸适配体A2连接而成；所述核酸适配体A1为序列表中序列8所示的单链DNA；所述核酸适配体A2为序列表中序列7所示的单链DNA。2.根据权利要求1所述的核酸适配体A，其特征在于：所述连接为直接首尾相连或者通过linker首尾相连；所述linker为3-6个核苷酸T。3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体A，其特征在于：所述核酸适配体A为如下任一：(a1)序列表中序列1所示的单链DNA；(a2)序列表中序列2所示的单链DNA；(a3)序列表中序列3所示的单链DNA；(a4)序列表中序列4所示的单链DNA；(a5)序列表中序列5所示的单链DNA；(a6)序列表中序列6所示的单链DNA。4.一种用于检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体，其特征在于：所述凝血酶联核酸适配体是将凝血酶与权利要求1-3中任一所述的核酸适配体A特异性结合后制得的。5.一种用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板和如下(b1)或(b2)：(b1)权利要求1-3中任一所述的核酸适配体A和凝血酶；(b2)权利要求4所述的凝血酶联核酸适配体。6.权利要求1-3中任一所述的核酸适配体A或权利要求4所述的凝血酶联核酸适配体或权利要求5所述的试剂盒在检测黄曲霉毒素B1中的应用。7.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，为方法I或方法II：所述方法I为荧光检测法，包括如下步骤：(c1)将权利要求4所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液；(c2)将所述混合液加入到经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清；(c3)向所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的荧光多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后测定荧光信号的强度值，从而实现对所述待测溶液中黄曲霉毒素B1的检测；所述方法II为吸光光度检测法，包括如下步骤：(d1)将权利要求4所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液；(d2)将所述混合液加入到经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清；(d3)向所述经BSA-AFB1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的生色多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，王超，孙琳琳，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11