一种用于在体诱导成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物及其用途。具体地，本发明专利技术涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri‑iodothyronine，T3)。

【技术实现步骤摘要】
一种用于在体诱导成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途
本专利技术涉及用于在体诱导皮层固有成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途。具体地，本专利技术涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。
技术介绍
数十年以来，学术界就成年动物脑中大脑皮层中是否存在神经发生或者大脑皮层中的成熟神经元是否能够被诱导分裂，一直存在着广泛的争论。之前有报道称，在成年啮齿类动物1,2和猕猴3,4的大脑皮层中存在低水平的神经发生，但是其他的研究却报道称没有检测到这一神经发生5,6。在例如凋亡、卒中或者外伤的损伤刺激之下，室管膜下区(subventricularzone，SVZ)中的神经干细胞可以被激活并且分化成为神经前体细胞，神经前体细胞随后迁移到损伤刺激部位邻近区域并最终在原位分化成为成熟神经元7,8。而对于成年哺乳动物大脑皮层中的固有成熟神经元，学术界一般认为其不具有分裂能力9-11。而对于神经退行性疾病、卒中、脑外伤而言，成熟神经元不具有分裂能力这一性质是这些疾病治疗中的巨大障碍。此外，脑衰老以及衰老相关的神经退行性病变也与神经元的损失有关。尽管脑中存在一定水平的神经发生，但是其水平过低不足以补偿神经元的损失，另一方面，尽管神经前体细胞在某些情况下可以迁移并在特定部位分化成为神经元，但是其难以被利用来预防衰老和治疗神经退行性疾病7，也不足以逆转上述状况。神经退行性疾病治疗的关键在于固有的成熟神经元的自发地或者被诱导地自我更新或分裂15。因此，学术界一直渴望开发出一种技术来实现大脑皮层固有成熟神经元的诱导分裂。这种技术将会为以下疾病的治疗提供希望：神经退行性疾病以及来自起因于卒中或外伤的脑和脊髓损伤。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于诱导大脑皮层固有成熟神经元分裂的生长因子/神经营养因子组合物。特别地，本专利技术提供了用于诱导成熟神经元大量分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。在某些实施方案中，本专利技术的组合物还包含另外的生长因子和/或神经营养因子。在某些实施方案中，在本专利技术的组合物中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为1-400微克/ml，T3的终浓度为1-1000微克/ml。在某些实施方案中，在本专利技术的组合物中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为10微克/ml，T3的终浓度为50微克/ml。在某些实施方案中，本专利技术的组合物还包含纤维蛋白基质和/或纤溶酶原混合物。在某些实施方案中，所述成熟神经元是大脑皮层固有成熟神经元。在另一个方面，本专利技术提供了表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)在制备用于诱导成熟神经元分裂的药物中的用途。在另一个方面，本专利技术提供了表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)组合在制备用于治疗神经退行性疾病、帕金森病、多发性硬化症的治疗、ALS、阿尔茨海默病、糖尿病神经病变、卒中或脑外伤的药物中的用途。在另一个方面，本专利技术的组合物可用于以下用途：例如周围神经的再生、脊髓中的轴突再生、促进某些细胞的分化、靶神经元细胞存活的增加、脑血流量的增加、脊髓损伤的治疗、神经退行性疾病的治疗、中风或脑缺血症的治疗、亨廷顿氏病的治疗、帕金森氏病的治疗、多发性硬化症的治疗、ALS的治疗、阿尔茨海默氏的治疗、糖尿病神经病变的治疗。在一个具体实施方案中，将生长因子/神经营养因子组合(cocktail)与三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)的组合物(在本文中，也称之为cocktail)注射到成年大鼠的初级运动M1大脑皮层，2-4天以后观察到被MAP2+/NeuN+或者MAP2+/Hu+所标记的大量局部神经元可以被诱导分裂，NeuN和Hu在诱导分裂的神经元中显著下调，这些诱导分裂的神经元不表达双皮质素(doublecortin，DCX)，该标志物仅在迁移的神经前体细胞中表达7,13,14。通过逆行神经示踪和延迟诱导神经分裂相结合的方法，本专利技术人不仅仅鉴定到投射到脊髓的诱导分裂的神经元，还确认这些诱导分裂的神经元来源于固有的(原位的)成熟神经元，而不是从别处迁移来或者由神经前体细胞形成的神经元。此外，本专利技术人通过5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)染色研究了诱导分裂神经元的存活，在将诱导分裂组合物注射到M1大脑皮层后36小时期间，腹膜内注射BrdU共3次，然后观察BrdU+/NeuN+神经元数量，在4周、8周时都检测到大脑皮层显微注射部位周围有大量的BrdU+/NeuN+神经元，而且4周和8周之间没有显著差异。本专利技术人出人意料地发现三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)可降低Necdin表达，导致E2F1输入核的增加，进而活化成熟神经元，最终使得神经元重新进入细胞周期。并且还出人意料地发现使用低浓度的BDNF和NGF使得MAPK信号通路活化，从而减轻高浓度T3所导致的神经元凋亡。使用这一方法，本专利技术人成功地诱导了固有的成熟神经元在成年动物脑大脑皮层III-V层的原位分裂。一般来说，通过3H-胸腺嘧啶([3H]TdR)和BrdU标记来显示神经发生，其能够在细胞周期的S期DNA合成过程中掺入到DNA中16。但是，一些DNA合成可能与有丝分裂无关，例如基因修复或者凋亡过程中，所以上述标记物显示的是DNA合成10,15,16，有可能无法准确表征细胞分裂的状态。此外，这两种标志物之间也缺乏一致性，即便在同一个动物中结果也常常不一致9,17-19。所以，为了排除这些影响，从而准确地确证神经元分裂的发生，本专利技术人使用了Hoechst33258来标记DNA，通过带标记染色体的形态和排列(arrangement)来确定分裂中神经元的有丝分裂阶段(参见图1)。此外，为了避免内源神经前体细胞的活化和迁移，从而确定分裂神经元的来源，本专利技术人尽可能地降低损伤，例如使用玻璃微针(OD约80微米)，减少注射的量，并且延长显微注射时间(长达10分钟)，等等。微透析仅进行24-36小时，之后立即处死动物。为了避免分裂中细胞的细胞核与另一细胞的核周质在照片中重叠所导致的错误结论9,20，本专利技术人使用了激光扫描共聚焦显微镜进行分层扫描，并且在单张照片或3D照片中展示细胞核与核周质的关系。更优选地，为了诱导更多的神经元分裂，除了T3和BDNF、NGF之外，本专利技术人将另本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri‑iodothyronine，T3)。

【技术特征摘要】
1.用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。2.根据权利要求1的组合物，其还包含另外的生长因子和/或神经营养因子。3.根据权利要求1的组合物，其中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为1-400微克/ml，T3的终浓度为1-1000微克/ml。4.根据权利要求1的组合物，其中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为10微克/ml，T3的终浓度为50微克/ml。5.根据权利要求1的组合物，其还包含纤维蛋白基质和/或纤溶酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少君，刘若虚，林世德，马洁，景书谦，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11