本发明专利技术公开了一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。所述的真核表达穿梭载体，是一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有ＥｃｏＲＶ识别序列。用本发明专利技术的真核表达穿梭载体构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，并且该载体含有两个真核复制起点，可以在表达Ｔ抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。本发明专利技术的真核表达穿梭载体具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。
技术介绍
哺乳动物细胞真核表达载体是目前市场中最常见的表达载体之一，被广泛的应用于科研，生产等领域。与原核蛋白表达载体相比，由哺乳动物细胞翻译的蛋白，经过翻译后的加工修饰过程，所以在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。目前已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和生产，有些产品已投入临床应用或试用。 目前市场上使用的真核表达蛋白质粒构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统的连接方法连接的，首先选择合适的酶切位点，要求连接的外源基因片段中没有所选择的酶切位点，然后用限制性内切酶酶切载体与外源基因片段，再用T4DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐，成本高(需要购买内切酶与连接酶)，连接效率较低等问题，在构建过程中PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种真核表达穿梭载体及其构建方法与应用。 本专利技术所提供的真核表达穿梭载体是一种环状载体，命名为pHP-DSV40，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有EcoRV识别序列。 其中，所述真核复制起点具体可为SV40病毒复制起点。所述两个转录方向相同的启动子具体可为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子；所述多聚腺苷酸加尾信号具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述两个真核复制起点的位置没有特别的限制，最好尽量均分于所述环状载体的中。 本专利技术的pHP-DSV40的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。 本专利技术还提供了一种线性的载体。 所述线性的载体是用EcoRV酶切pHP-DSV40得到的。 本专利技术的另一个目的是提供pHP-DSV40的构建方法。 本专利技术所提供的pHP-DSV40的构建方法，包括如下步骤 1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A； 2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’进行PCR扩增，得到片段B； 3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I； 4)以重组载体I为模板，用如下引物5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D； 5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物 5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C； 6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II； 7)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物5’ GAGTTAGGGGCGGGATCGCCGCTACAGGGCG 3’和5’ GGAGGCCTAGGCTTTTGCAGGAAAGAACATGTGAG3’进行PCR扩增，得到片段F； 8)以重组载体II为模板，用如下引物5’ CGCCCTGTAGCGGCGATCCCGCCCCTAACTC 3’和5’ CTCACATGTTCTTTCCTGCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’进行PCR扩增，得到片段E； 9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，获得pHP-DSV40。 本专利技术的pHP-DSV40可作为外源基因的表达载体，导入能表达SV40大T抗原的肿瘤细胞中，来表达外源蛋白。 以本专利技术的pHP-DSV40为出发载体，利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本专利技术的pHP-DSV40构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。本专利技术的pHP-DSV40含有两个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。本专利技术的真核表达穿梭载体具有很好的应用前景。 附图说明 图1为pHP-DSV40图谱。 图2为绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察结果。 具体实施例方式 实施例1、pHP-DSV40的构建 1)pHP的构建 设计引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游、pHP Vector2上游和pHPVector2下游，引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游、pHP Vector2上游和pHP Vector2下游的序列如下 pHP Vector1上游5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3’； pHP Vector1下游5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’。 pHP Vector2上游5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3’(划线部分为EcoR V酶识别位点)； pHP Vector2下游5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACA TGT 3’。 以pEGFP-N1(Invitrogen)质粒为模板，用引物pHP Vector1上游和pHP Vector1下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒为模板，用引物pHP Vector2上游和pHPVector2下游PCR扩增片段B。 PCR反应体系10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。 反应条件94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。 PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。 50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pHP。 2)pHP-SV40的构建 设计引物SV40(1)上游和SV40(1)下游、p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环状载体，包含原核复制起点、两个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次由两个转录方向相同的启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有ＥｃｏＲＶ识别序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，刘芹防，马广鹏，蒲娟，王帅，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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