一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：将PEI/PVA纺丝液，静电纺丝，蒸汽交联，得到PEI/PVA纳米纤维膜；表面修饰两性离子MPC和靶向配体4‑FBA‑PEG‑RGD得到PEI/PVA‑PMPC‑RGD；与鱼骨形PDMS微流控通道盖片等离子键合，得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片，可用于循环肿瘤细胞分选。本发明专利技术主体材料制备工艺简单，原料廉价易得，样品处理过程操作简便、可快速实现血液中循环肿瘤细胞的高效捕获和无损释放，具有优异的抗蛋白和抗血细胞粘附性能，提高了捕获细胞的纯度，在CTC分选和检测分析方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法
本专利技术属于微流控芯片和细胞分选
，特别涉及一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法。
技术介绍
据世界卫生组织在2014年的报告显示，癌症已成为威胁人类生命和健康的头号杀手。在癌症死亡病例中有超过90％的癌症患者死于肿瘤的转移和复发。肿瘤转移初期，肿瘤细胞从原发灶实体瘤上脱落，进入血液，成为循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTC)。有研究表明，许多肿瘤在直径不足一毫米的情况下，已经在血液里查到CTC[PiergaJ-Y,etal.Clinicalsignificanceofimmunocytochemicaldetectionoftumorcellsusingdigitalmicroscopyinperipheralbloodandbonemarrowofbreastcancerpatients.ClinicalCancerResearch.2004,10:1392-1400.]，且癌症病人外周血中CTC的数量不仅与肿瘤的分期明显相关，还可以反映肿瘤治疗(手术或化疗)后的复发情况，以及个体对肿瘤治疗的敏感性[MaheswaranS,etal.DetectionofmutationsinEGFRincirculatinglung-cancercells.NewEnglandJournalofMedicine.2008,359:366-377.]。因此，CTC的检测对于肿瘤的早期诊断、疾病发展预测、疗效评估、预后判断和个体化治疗具有极其重要的意义。但是血液中CTC数目极少，每毫升血液中的血细胞超过109个，而CTC只有几个到几百个，因此采用常规手段难以实现CTC的捕获和分离。近年来，基于微流控技术和纳米材料的检测平台受到了人们广泛的关注。微流控芯片是通过设计和制作出各种结构、尺寸在微米量级的管道进行实验的装置。微流控通道的特征尺度与细胞尺寸相匹配，通过对细胞周围流场的精细控制，或是芯片上加工的各种微型结构，可以对细胞进行各种操作。此外，微流控芯片具有装置体积小、样品需求量少以及对微量液体精准操作的优点，非常适用于血液中CTC的分选。例如，Nagrath等构建了有78000个微柱阵列的微流控芯片，通过在微柱表面固定EpCAM抗体，基于细胞尺寸和EpCAM与细胞表面抗原特异性结合高效捕获CTC，大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的效率[Nagrath,S.,etal.,Isolationofrarecirculatingtumourcellsincancerpatientsbymicrochiptechnology.Nature,2007,450(7173):1235-1239.]。静电纺纳米纤维具有极大的比表面积，能提供大量的细胞接触位点，使单位体积内捕获细胞的数量增加，因而静电纺纳米纤维被越来越多地应用在CTC的捕获与检测领域。此外，静电纺纳米纤维还具有制备工艺简单、原料来源广泛、便于后续多功能化修饰等诸多优点。例如，聚乙烯亚胺/聚乙烯醇(PEI/PVA)静电纺纳米纤维是一种以水为溶剂的绿色纳米纤维，且PEI/PVA纳米纤维表面带有大量的氨基和羟基便于后续的功能化修饰，可将靶向配体修饰在纳米纤维表面用于癌细胞的特异性捕获。一般来说，为了获得高效和灵敏的捕获效果，通常需要在通道内部或者纳米材料表面修饰靶向配体，利用靶向配体与肿瘤细胞表面标记物的特异性结合，实现CTC的快速、高效捕获。目前，CTC捕获大多以抗上皮细胞黏附分子(EpithelialCellAdhesionMolecule)Anti-EpCAM抗体作为靶向材料，特异性地捕获上皮来源的癌细胞。但这类方法存在一定的局限性，以EpCAM抗原作为细胞标志物，仅能用于捕获上皮来源的癌细胞，且在肿瘤发生转移的过程中，肿瘤细胞会发生上皮间充质转化(EMT)，从而导致细胞表面EpCAM表达量下调，而不能被EpCAM抗体特异性识别并结合。因此，需要发掘新的肿瘤细胞表面标志物，筛选出一种新型、灵敏的靶向分子取代EpCAM抗体。整合素αvβ3参与肿瘤血管的生成和肿瘤的转移过程，在多种肿瘤细胞表面有高表达，而RGD肽可以被整合素αvβ3受体识别，与整合素αvβ3过表达的癌细胞特异性结合。Luo等人在纳米材料表面修饰PEG化的RGD多肽后，可成功实现对αvβ3表达阳性的癌细胞(如U87MG)和肿瘤模型的特异性成像[LuoY,etal.RGD-functionalizedultrasmallironoxidenanoparticlesfortargetedT1-weightedMRimagingofgliomas.Nanoscale.2015,7:14538-14546.]。同时，通过查阅大量文献发现，RGD对SKOV-3、U87MG、A549、HepG2等多种癌细胞具有高效、灵敏的靶向能力，可用于癌细胞的捕获和分离。研究表明，使用微纳米基质或含特定结构设计的微流控芯片可获得理想的分离效率，但CTC目前的分离纯度普遍较低[ShengWA,etal.MultivalentDNAnanospheresforenhancedcaptureofcancercellsinmicrofluidicdevices.ACSNano,2013,7(8):7067.]。因此通过专利技术新材料或发展新方法，保证CTC高效捕获的同时，采取有效手段提高CTC的分离纯度是当前的一个重要研究方向。Wang等人利用两性离子半胱氨酸修饰的纳米粒子用于肿瘤的磁共振成像，发现两性离子具有良好的抗污性能，采用两性离子修饰可赋予纳米材料优异的抗蛋白黏附性能，同时两性离子修饰还可减少巨噬细胞的吞噬，延长纳米材料在血液中的循环时间[WangP,etal.AntifoulingManganeseOxideNanoparticles:Synthesis,Characterization,andApplicationsforEnhancedMRImagingofTumors.AcsAppliedMaterials&Interfaces.2017,9:47-53.]。同时，查阅文献发现，修饰两性离子的纳米材料可获得血液惰性表面，减小血细胞黏附[ChangY,etal.Blood-InertSurfacesviaIon-PairAnchoringofZwitterionicCopolymerBrushesinHumanWholeBlood.AdvFunctMater.2013,23:1100-1110.]。因此，可以通过在材料表面修饰两性离子，使其获得血液惰性表面，从而减少血液中蛋白质和血细胞的非特异性黏附，提高最终捕获到的CTC的纯度。目前，常见的CTC分选技术大多是对血液中的CTC进行捕获或者富集，捕获后的肿瘤细胞继续保留于基质上，不利于后续的检测分析，如细胞培养、PCR分析等。Yu等人于2014年发表在《Science》上的研究成果表明，若能将CTC从捕获基质有效解离并对其进行体外培养，结合基因测序与体外药敏实验，将有助于建立基于CTC的肿瘤个性化诊断技术[YuM,etal.Exvivocultu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：(1)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中，磁力搅拌，得到质量分数为8～12wt％的PEI/PVA纺丝液，静电纺丝，得到PEI/PVA纳米纤维膜，蒸汽交联，得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜；其中PEI和PVA的质量比为0.5：1～2；(2)将步骤(1)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中，加入三乙胺，再逐滴加入2‑溴异丁酰溴BBIB，冰浴反应，然后室温反应，经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA‑Br；其中无水二氯甲烷、三乙胺和2‑溴异丁酰溴的用量比为10mL：500μL：410～415μL；(3)在氮气氛围下将步骤(2)得到的PEI/PVA‑Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液中，继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶、2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体，聚合反应，然后经超声清洗，真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA‑PMPC‑Br；其中混合溶液、CuBr、联吡啶、MPC单体的用量比为10mL：105～110mg：230～240mg：1.75～1.80g；(4)将末端为氨基和马来酰亚胺基的PEG化试剂NH2‑PEG‑Mal溶解于溶剂中，加入RGD肽，室温磁力搅拌，然后透析，真空冷冻干燥得到NH2‑PEG‑RGD，溶解于溶剂中，加入对醛基苯甲酸4‑FBA，再次室温磁力搅拌，然后透析，真空冷冻干燥得到4‑FBA‑PEG‑RGD；其中溶剂、NH2‑PEG‑Mal、RGD肽、4‑FBA的用量比为5mL：28～32mg：10.35～10.40mg：2.2～2.3mg；(5)将步骤(4)得到的4‑FBA‑PEG‑RGD溶解于溶剂中，磁力搅拌充分溶解，先后加入催化剂和步骤(3)得到的PEI/PVA‑PMPC‑Br，回流反应，然后超声清洗，真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体4‑FBA‑PEG‑RGD功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA‑PMPC‑RGD；其中溶剂和催化剂的用量比为20mL：25～35μL；(6)将负载步骤(5)得到的PEI/PVA‑PMPC‑RGD的载玻片作为基底，与鱼骨形聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片，通过等离子键合，得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。...

【技术特征摘要】
1.一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：(1)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中，磁力搅拌，得到质量分数为8～12wt％的PEI/PVA纺丝液，静电纺丝，得到PEI/PVA纳米纤维膜，蒸汽交联，得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜；其中PEI和PVA的质量比为0.5：1～2；(2)将步骤(1)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中，加入三乙胺，再逐滴加入2-溴异丁酰溴BBIB，冰浴反应，然后室温反应，经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br；其中无水二氯甲烷、三乙胺和2-溴异丁酰溴的用量比为10mL：500μL：410～415μL；(3)在氮气氛围下将步骤(2)得到的PEI/PVA-Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液中，继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体，聚合反应，然后经超声清洗，真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br；其中混合溶液、CuBr、联吡啶、MPC单体的用量比为10mL：105～110mg：230～240mg：1.75～1.80g；(4)将末端为氨基和马来酰亚胺基的PEG化试剂NH2-PEG-Mal溶解于溶剂中，加入RGD肽，室温磁力搅拌，然后透析，真空冷冻干燥得到NH2-PEG-RGD，溶解于溶剂中，加入对醛基苯甲酸4-FBA，再次室温磁力搅拌，然后透析，真空冷冻干燥得到4-FBA-PEG-RGD；其中溶剂、NH2-PEG-Mal、RGD肽、4-FBA的用量比为5mL：28～32mg：10.35～10.40mg：2.2～2.3mg；(5)将步骤(4)得到的4-FBA-PEG-RGD溶解于溶剂中，磁力搅拌充分溶解，先后加入催化剂和步骤(3)得到的PEI/PVA-PMPC-Br，回流反应，然后超声清洗，真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体4-FBA-PEG-RGD功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-RGD；其中溶剂和催化剂的用量比为20mL：25～35μL；(6)将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-RGD的载玻片作为基底，与鱼骨形聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片，通过等离子键合，得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。2.根据权利要求1所述的一种包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中磁力搅拌的工艺参数为：搅拌温度为80～100℃，搅拌时间为3～5h；静电纺丝的工艺参数为：选用16号针头，纺丝电压为28.5kV，流速0.6mL/h，接收距离20cm，环境温度20～25℃，湿度30～40％，接收装置为平放在铝箔纸上的直径为14mm的圆形盖玻片或长方形载玻片；蒸汽交联的工艺参数为：在底部放有质量分数为20～30％的戊二醛溶液的真空干燥器中抽真空至真空度达到0.08～0.09Mpa，交联处理11～13h。3.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：史向阳，肖云超，王梦媛，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海,31