利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＧＦＰ－ＰｏｌｙＡ重组质粒或插有外源基因的ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＧＦＰ－ＰｏｌｙＡ重组质粒或ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＰｏｌｙＡ质粒或插有外源基因的ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＰｏｌｙＡ质粒及蛋白酶抑制剂，２５℃～２９℃水浴，即得目的蛋白的表达。本发明专利技术的有益之处在于：本发明专利技术是在２５℃～２９℃条件下表达蛋白，低温（常规是在３７℃）条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成，利于蛋白的分离纯化。同时，本发明专利技术所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内合成蛋白质。］

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用了家蚕后部丝腺体外表达 系统。
技术介绍
目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等表达系统 (下文中往往称为"细胞系统")作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于 其功能保留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白 质的表达阻止了细胞生长而存在许多不能被容易表达的蛋白质。而体外表达系 统相对而言没有上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不伤害生物体的情 况下合成蛋白质。另外由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统 相比，可在短时间内合成蛋白质。此外，由于体外表达系统还用来大规模生产 由不被生物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方 法。家蚕(Bombyx mori)是一种具有强大泌丝能力的昆虫。蚕丝蛋白由丝素 (fibroin, Fib)禾卩丝胶(sericin， Ser)组成。丝素由重链(heavy chain, fib-H)、轻链(light chain, fib-L)和FhxPP25 (fibrohexamerin)以摩尔比 6:6:1组成。形成茧层的丝蛋白主要在家蚕幼虫5龄中、后期合成。在短短 的4 5天内，后部丝腺每个细胞合成丝素约300 "g，亦即2条后部丝腺(大约 1 000多个细胞)每小时合成丝素2 mg左右，平均每秒钟合成6X108丝素分子， 比肝细胞合成血清白蛋白快60倍以上。如此高的蛋白合成强度，在其他动物细 胞内是罕见的。因此，丝蛋白基因启动子是具有较强时空特异性和强大启动能 力的天然启动子。家蚕丝素蛋白轻链基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。可以利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工 厂。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术提供一种利用家蚕后部丝腺体外表达系 统合成蛋白质的方法。本专利技术的一种，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的 pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25。C 29X:水浴，即得目的蛋白的表达。 所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括(1) 取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75%乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置 于0.9c/。的生理盐水或PBS中，取后部丝腺，一80 一6CTC保存；(2) 取以上保存的后部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上 匀浆；取匀浆液于1.5ml EP管中，2°C 6°C， 10000 14000rpm离心10 15min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕后部丝腺组织提取液。所述pUC 19-FL-Po 1 yA质粒的制备方法包括(1) 以家蚕基因组DNA为模板，L-l和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子 序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒 pUC19-FL;1l-1: 5' - ccggaa/ttccgactcgccaagttacgtc-3';H_ ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3' (2) 以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L polyA (1)，经SalI和Hindin双酶切后定向克隆至pUQ9-FL中fib-L启动子下游，获 得重组质粒pUC19-FL-PolyA;L-3: 5'_ gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3'; 1v-4: 5'- gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3'。 所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括(1) 以家蚕基因组DNA为模板，L-l和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子 序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒 pUC19-FL;L-l: 5'- ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3';L-2: 5'- ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc—3';(2) 以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-L polyA (2);L-5: 5'-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3'; L-6: 5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';(3) ，以质粒pEGFP-Nl为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因 序列；L-7: 5'-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'; L-8: 5'-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3';(4) 以fib-L polyA (2)禾叩FP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引 物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-L polyA (2)禾口GFP报告基因序列的片 段，即GFP-PolyA，经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL 中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA，L-6: 5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';L-7: 5Lccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'。本专利技术的有益之处在于本专利技术是在25X: 29'C条件下表达蛋白，低温 (常规是在37°C)条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成， 利于蛋白的分离纯化。同时，本专利技术所述的方法不受细胞的限制，可在短时间 内合成蛋白质。附图说明图1、本专利技术的实施例的重组质粒pUC19-FL-PolyA;图2、本专利技术的实施例的重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA;图3、本专利技术的实施例的检测蛋白表达的电泳图中M，标准分子量蛋白；1， 0小时取样；2， 3小时取样；3， 6小时取 样；4， 12小时取样；5， 18小时取样。具体实施例方式本专利技术选取四龄或五龄时期的家蚕，解剖获得家蚕后部丝腺后，置于匀浆器中，加入适量生理盐水或PBS，冰上匀浆，离心获得上清液，即为家蚕后部 丝腺提取液。将家蚕后部丝腺提取液在25。C 29。C水浴中孵育，分0， 3h， 6h， 12h， 18h， 24h取样，用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定此系统是否具有合成蛋白 的能力。重组质粒的构建1、 重组质粒pUC19-FL-PolyA以家蚕基因组DNA (Genbank M76430)为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩 增出f ib-L启动子序列(约605 bp)，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至 载体pUC19 (promega公司)中，获得重组质粒pUC19-FL。同样以家蚕基因组 DNA (Genbank M76430)为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L的polyA 加尾信号(约286 bp)，经SalI和HindlII双酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于：在家蚕后部丝腺组织提取液中加入ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＧＦＰ－ＰｏｌｙＡ重组质粒或插有外源基因的ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＧＦＰ－ＰｏｌｙＡ重组质粒或ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＰｏｌｙＡ质粒或插有外源基因的ｐＵＣ１９－ＦＬ－ＰｏｌｙＡ质粒及蛋白酶抑制剂，２５℃～２９℃水浴，即得目的蛋白的表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，夏佳音，陈健，吕正兵，陈琴，聂作明，盛清，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]