以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种生物工程领域的以ｒｈＤＳＬ重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，在ＨＳ／ＰＣｓ体外培养体系中加入ｒｈＤＳＬ重组蛋白及早期造血因子，采用这两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。所述ｒｈＤＳＬ重组蛋白为含有６×Ｈｉｓ标签的Ｎｏｔｃｈ配体Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ－１的衍生多肽，衍生多肽由含有进化中的保守结构区ＤＳＬ和与之相邻的Ｎ－端５０个氨基酸构成，共９９个氨基酸，其氨基酸序列为：ＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩ。本发明专利技术中ｒｈＤＳＬ重组蛋白在造血干／祖细胞扩增中具有分子量小，使用方便，节约成本的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物工程
的细胞扩增方法，特别的是一种以rhDSL重组 蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法。
技术介绍
iS^jft,l&ik^MM^M (Haematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 已成为治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫系统疾病及某些基因缺陷疾病的重要手 段之一。造血干细胞主要来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血。尽管与其他来源的干细 胞相比，脐血干细胞具有来源丰富、抗原性弱、移植后并发症少等优点，但又存在数量不足 的缺陷，造成了成人移植的限制。为得到治疗所需的细胞数量，研究人员试图通过不同手 段对HS/PCs进行规模化扩增。但是目前常用的方法扩增HS/PCs (Haematopoietic Stem/ ProgenitorCells)的效率十分有限，而且HS/PCs在体外扩增的过程中自我更新能力下降 并显示出分化的特征，导致其归巢和长期造血重建能力的降低，所以从根本上解决HSCT面 临的供体严重短缺已成为亟待解决的问题。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重要通 路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、配体及其下游的 信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节包括干细胞在内的多种 细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。干细胞是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的细胞，能够产生 高度分化的功能细胞。Notch信号对多潜能干细胞的定向分化和自身复制具有决定性的调 控作用。以干细胞为中心的再生医学是用功能正常的细胞或组织替代功能减退或受损的 细胞组织，将定向分化后的细胞用于治疗阿尔茨海默症、帕金森病、糖尿病、白血病等疾病， Notch信号传导通路通过调节干细胞的分化增殖将在这一领域中发挥重要作用。在少数情 况下，例如神经干细胞向星形胶质细胞分化的过程中，Notch信号传导通路具有促进分化作 用。对于其它多种干细胞而言，当Notch受体与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖； 而当Notch信号活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞，Notch信号传导通 路目前被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研究方向之一。目前，Notch信号传导通路在 干细胞再生医学中的应用主要集中在通过活化Notch信号通路进行干细胞的体外扩增培 养。在干细胞培养过程中，活化Notch信号传导途径可以调控其增殖分化从而服务于以干 细胞生物治疗和组织工程，其策略主要是在含有可溶性配体的培养基中培养干/祖细胞、 或者将配体结合于固相表面以模拟体内配体的跨膜结构来培养干/祖细胞。由于每一种 类型的细胞需要与其相适应的含有适量细胞因子和生长因子的独特培养条件，所以通过激 活Notch通路来维持干细胞的培养和进行组织工程的研究还存在一些困难，尽管如此，在 造血干细胞的培养中，通过激活Notch通路来维持干细胞的自我更新已经取得了一定的进 展。鲁茁壮等(中国实验血液学杂志，2003，11 (3) :222 226)克隆表达了人Notch配体 Delta-likel(hDlll)的胞外区(hDlI-Iext)，并经集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞4具有扩增作用。Han等(Blood，2000，95 (5) :1616 1625)构建了来自于人hDlll的可溶 性重组蛋白hDlll·、由DSL结构域及N-端序列构成)，经小鼠细胞体外实验证实，在联合 其它细胞因子的情况下，可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖。目前已经发现的人的 Notch 配体有 Jaggedl、Jagged2、DeltaU Delta3、Delta4。 Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的DSL (Delta/Serrate/ Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体的过程中起关键作用。来自于野 生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。体外实验已经证明，从 JaggedUDeltal中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K, et al. J Biol Chem,1999,274(46) :32961 32969)。经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN101096654A，专利技术名称为 “以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法”，该专利提及的方法步骤为 "(1)从髓、外周血或脐带血中取样，用密度梯度离心分离出单核细胞，然后用CD34分离试 剂盒对CD34细胞进行标记，采用免疫磁珠技术对CD34细胞进行纯化，得到CD34+细胞；(2) 采用含10% -20%胎牛或人血清的细胞培养基对上述CD34+细胞进行培养，加入细胞因子， 加入蛋白，培养1周，换入细胞培养基，并重新加入蛋白再继续培养扩增1周，得到增殖了的 造血干细胞、祖细胞。，，该专利技术中使用的GST-hDSL相对本专利技术中的rhDSL重组蛋白，分子量 大、结构复杂，不利于相关实验操作中的使。且该专利技术中对造血干/祖细胞的扩增时间为一 周，扩增时间过长，可能影响了造血干/祖细胞的分化潜能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以rhDSL重组蛋白扩增造血干 细胞及祖细胞的方法，首次将rhDSL运用于人脐血干细胞及祖细胞的扩增，并提供优化了 的扩增条件，为Notch信号传导通路在造血干细胞体外扩增中的应用和发展提供了实验基 石出。本专利技术是通过如下技术方案实现的，本专利技术包括如下步骤第一步，rhDSL重组蛋白的制备首先构建rhDSL的重组表达质粒pQE30_hDSL，然 后以大肠杆菌DH5ci为宿主表达rhDSL，并采用Q S印harose阴离子交换层析与金属离子 Ni2+亲和层析相结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到rhDSL重组蛋白。所述rhDSL重组蛋白，为含有6 XHis (组氨酸)标签的Notch配体Delta-Iike-I 的衍生多肽。所述的衍生多肽，由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨 基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHS SGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30_hDSL，是指以重组质粒pGEX_2T/ hDSL (林小娟等，现代生物医学进展，2008，8 (4) 612)为模板，PCR的方法扩增hDSL基因片 段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸，共 298bp。割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30(含6XHis标签)经限制性内 切酶HindIILBamH I双酶切。连接割胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备 的DH5ci感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框正确。(以上为常规技术和条件，可以重复实施)所述以大肠杆菌DH5 α为宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以ｒｈＤＳＬ重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：　第一步，ｒｈＤＳＬ重组蛋白的制备：首先构建ｒｈＤＳＬ的重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｈＤＳＬ，然后以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主表达ｒｈＤＳＬ，并采用Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子交换层析与金属离子Ｎｉ↑［２＋］亲和层析相结合的纯化方法进行ｒｈＤＳＬ重组蛋白的纯化，得到ｒｈＤＳＬ重组蛋白；　所述ｒｈＤＳＬ重组蛋白为含有６×Ｈｉｓ标签的Ｎｏｔｃｈ配体Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ－１的衍生多肽，所述的衍生多肽由含有进化中的保守结构区ＤＳＬ和与之相邻的Ｎ－端的５０个氨基酸构成，共９９个氨基酸，其氨基酸序列为：ＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩ；　第二步，在ＨＳ／ＰＣｓ体外培养体系中加入ｒｈＤＳＬ重组蛋白及早期造血因子，采用这两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩伟，赵梅，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]