本发明专利技术提出了一种快速高效的植物人工微ＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡｓ）表达载体构建方法，它是通过以下两大步骤完成的。一）含ａｍｉＲＮＡｓ表达单元的供体质粒的构建：１）选择并改造供体骨架载体，２）引物设计，３）ＰＣＲ扩增，４）同源重组转化筛选；二）将ａｍｉＲＮＡｓ表达单元克隆到植物双元载体上：１）选择并改造受体载体，２）采用接合辅助的遗传整合克隆方法将ａｍｉＲＮＡｓ表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物ａｍｉＲＮＡｓ表达载体。在改造供体骨架载体和受体载体时，分别克隆了筛选标记基因或报告基因表达单元和大肠杆菌条件致死基因表达单元。本发明专利技术不需要酶切连接反应，也不需要对载体或目的片段进行特殊处理，整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，能够快速、高效、零背景、高通量地构建植物ａｍｉＲＮＡｓ表达载体。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种快速高效的植物人工微ＲＮＡ表达载体构建方法，其特征在于步骤为： 一）含ａｍｉＲＮＡｓ表达单元的供体质粒的构建 １）选择并改造供体骨架载体，在ｍｉＲＮＡ５’与３’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因表达单元，在５’侧翼序列的前面添加一个控制植物ａｍｉＲＮＡｓ表达的启动子，在３’侧翼序列的后面添加一终止子序列，得到植物ａｍｉＲＮＡｓ的供体骨架载体； ２）引物设计，根据在线软件或相关运算规则，设计针对目的基因进行ＲＮＡ干扰的靶序列，首先以ｍｉＲＮＡ的环序列为基础，设计一条长度与其相同的引物①；然后根据前面所述的ａｍｉＲＮＡｓ的供体骨架载体上ｍｉＲＮＡ的５’侧翼序列和３’侧翼序列，设计一对ＰＣＲ引物②和③，该对引物应该在与ａｍｉＲＮＡｓ供体骨架载体特异性退火的序列５’末端加上已设计的靶序列ＴＳ１、ＴＳ２，除此之外，引物②还应在５’末端加上与引物①特异性退火的序列ＬＳＰ１，引物③的５’末端还应加上引物①５’末端的１０－１５ｎｔ序列ＨＲ，使两者末端产生１０－１５ｂｐ的同源序列； ３）ＰＣＲ扩增，利用２）中设计的引物①②③，以前面所述的ａｍｉＲＮＡｓ供体骨架载体为模板，经套式ＰＣＲ扩增，获得的ＰＣＲ产物含有ａｍｉＲＮＡｓ供体骨架载体上的ｍｉＲＮＡ的侧翼序列和干扰目的基因的靶序列，而且ＰＣＲ产物５’和３’末端分别带有部分ｍｉＲＮＡ的环序列，同时ＰＣＲ产物缺失了ａｍｉＲＮＡｓ骨架载体中的筛选标记基因或报告基因表达单元； ４）同源重组转化筛选，获得的ＰＣＲ产物直接转化大肠杆菌ＤＨ１０β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组自环化，得到含有干扰目的基因的靶序列的ａｍｉＲＮＡｓ表达单元的供体质粒； 二）将人工微ＲＮＡｓ表达单元克隆到植物双元载体上 １）选择并改造受体载体，首先在植物双元载体上克隆一大肠杆菌条件致死基因表达单元，而且该表达单元两端分别带有一个Ｉ－ＳｃｅＩ酶切位点以及一段与含有ａｍｉＲＮＡｓ表达单元的供体质粒同源的５０ｂｐ序列，将其转入大肠杆菌ＢＵＮ２１（ｐＭＬ３００）中； ２）采用接合辅助的遗传整合克隆方法将ａｍｉＲＮＡｓ表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物人工微ＲＮＡ表达载体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，严红，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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