微生物的检测制造技术

本发明专利技术涉及检测混合物（如啤酒）中微生物（如酵母）的改进方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测混合物(如啤酒)中的微生物、特别是酵母和细菌的改进方法。食品和饮料如啤酒的生产都需要同时测试某些微生物的存在与否，以确保最终产品的质量。酿造工艺例如需要几乎每个小时都在线测试体积至少为25ml的样品，样品的体积优选例如是250ml。然后必须从样品中分离有可能包含微生物、即酵母和细菌的特定物质，并接着进行测试以确定特定微生物是否存在。用于实现该目的的装置包括具有平均孔径为0.45μm的扁平过滤器的Bibby一次性真空过滤器单元以及具有接受器的Nalgene过滤器保持器，该保持器具有平均孔径为0.45μm或者0.2μm的扁平过滤器(例如参见Merck Laboratory Supplies Catalogue1998，p.482)。此等装置仅能够过滤最大体积为100ml的样品，其扁平表面积为50cm2，而且由于其使用的复杂性需要30分钟来检测样品。一旦已经过滤了最大体积的样品，这些过滤器就会被样品流体(如陈贮啤酒)中存在的某些物质如蛋白质阻塞，而任何随后的过滤将需要非常高的压力，使得细胞溶解(lysis)，妨碍了微生物的检测，并产生错误的结果。如以下详细描述的实验的结果所示，与使用本专利技术的装置和方法时所用的时间相比，现有技术的装置基本上需要更长的时间来分离并检测样品中的微生物。另外，在使用本专利技术的方法和装置时，随后回收并由此检测微生物较为简单而且容易，这是因为微生物以易于移动的“饼”(特定物质之相对未压实的低密度块)存在于膜的表面上，它们最小程度地侵入膜间隙中。相比较而言，特定物质在其他装置上以硬“饼干”(特定物质之相对高度压实的高密度块)的形式存在于膜表面上，微生物和其他特定物质阻塞并被捕集于膜间隙中。该饼干难以除去，而且使得难于处理以测试微生物的存在。另外，通过防止密实饼干的形成，本专利技术的装置能够在低的压力下运行。如果在更高的压力下运行，有可能发生细菌的溶解，这又会产生不正确的结果。高压也可导致细菌的变形，使它们由膜中通过，也会产生不正确的结果。根据本专利技术，其提供一种用于由样品混合物中回收微生物的方法，其包括以下步骤(i)使所述样品混合物由过滤装置的样品入口通过，该过滤装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，所述膜具有第一和第二端部、外表面和限定空腔(lumen)的内表面，各所述膜的第一端部是开口的而且与所述样品入口连通，由第二端部出来的流体被限制住，使所述样品混合物由所述膜中过滤，在所述膜的所述空腔中留下过滤物(filtrand)；(ii)重新悬浮在所述膜中的过滤物；以及(iii)检测所述过滤物中是否存在任何微生物。重新悬浮步骤(ii)可包括使溶胞剂(lysing agent)的溶液由所述膜的空腔中通过。这可例如通过以下方式完成将针筒连接在上述装置的一个端部上，并使溶胞缓冲液由膜的空腔中通过，或者可将膜放置在溶胞溶液中，然后使用连接在装置上的针筒，将溶胞溶液抽入膜的空腔中。由所述膜的第二端部出来的流体被限制住，使得所述样品混合物仅由所述膜过滤后才流出所述过滤装置。现有技术的过滤装置和方法包括以下文献GB 2135902、EP302949、WO 94/00222、WO 84/00015、US 5863501、US 5814179、US4501793、JP 4-135478(WPI摘要1992-205001)、JP 63-104615(WPI摘要1988-165566)、JP 63-088007(WPI摘要1988-145060)和JP 61-133105(WPI摘要1986-200908)。但是，上述文献中没有一个公开或者暗示了本专利技术的方法，而本专利技术的方法包括得到它们能够提供的结果所必须的各步骤。具体而言，现有技术没有暗示产生可重新悬浮的“饼”的形式的过滤物，相反，它们产生更密实的“饼干”形式的过滤物。而且它们都没有提示重新悬浮第一过滤步骤的过滤物作为随后处理步骤的一部分。例如，JP 63-104615公开了一种由流体中分离例如病毒的装置，其包括多个多孔中空纤维素纤维，这些纤维的一端嵌在填料中，并对大气是开口的，而另一端是封闭的。然而，该文献既没有提示膜应预先用洗涤剂进行处理，也没有提示应使用聚丙烯膜，而且没有提示可如何容易地在过滤物中检测微生物、特别是细菌和酵母，或者应重新悬浮过滤物。微生物检测步骤可包括检测所希望的微生物的任何检测方法。例如，简单常规的微生物测试是如下详细描述的ATP测试，其中溶解任何微生物，然后使用荧光素酶分析法检测所释放的任何ATP。或者，可使用微生物特异性抗体，或者可将过滤物铺板在普通营养培养基上，然后检测任何微生物菌落的生长。已发现用洗涤剂预先处理膜(例如用洗涤剂冲洗膜，然后任选地使膜干燥)可大大提高混合物由膜中通过的流率。在比较经洗涤剂处理的干燥膜和未经处理的干燥膜时，这尤为明显。该增加的流率确保了在收集微生物时不会使它们溶解或者迫使它们由膜中通过。有用的洗涤剂包括非离子洗涤剂，特别是Tween20，更特别的是20％Tween20溶液。在与由具有扁平膜以及类似总体积(尺寸)的单个装置所提供的表面积相比时，使用多个中空纤维过滤膜还提供了较大的进行过滤的表面积(通常至少大3倍)。这也使得在发生任何孔阻塞之前可以过滤相对更大体积的样品。对于包含大量可快速阻塞扁平过滤膜的特定物质的混浊样品(如烈性黑啤酒)，这是特别有用的。还发现过滤膜材料的精确性质也是特别重要的。发现平均孔径为0.2μm并预先用洗涤剂处理的市售聚丙烯中空纤维膜，与平均孔径为0.2μm而且甚至也用洗涤剂预先处理的聚砜膜相比，允许更大的流率。因此，在本专利技术的优选实施方案中，中空纤维膜可为聚丙烯膜。当然，也可使用其他的膜，特别是那些具有类似物理特征(如单位膜表面积具有类似的孔面积)的膜。本专利技术中使用的中空纤维膜可具有0.2μm的平均孔径。根据本专利技术还提供用于由样品混合物中分离微生物的过滤装置，该装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，各膜具有外表面和限定一个空腔的内表面，各膜的一个端部是开口的而且与过滤装置的样品入口连通，而另一个端部是闭口的。使用本专利技术的方法及装置测试微生物的难易程度可通过过滤速度来证实，这可由以下的实验结果看出。在使用本专利技术的方法及装置由给定体积的样品流体中回收特定物质时，所需要的时间仅是使用其他装置时所需要时间的几分之一，而且经常至少快10倍。本专利技术还具有以下重要的优点即使是过滤非常混浊的混合物时，对于给定的样品提供一致的结果，在不同组的结果之间可容易地实现至少99％的一致性。这与使用扁平膜时得到的较不一致的结果相比是非常有利的。通过以下参考附图的描述，本专利技术将更为显而易见，但这些描述仅是示例性的用一个过滤装置的形式来进行，但绝不是对本专利技术范围的限制，在附图中附图说明图1显示了根据本专利技术的第一个过滤装置及其在检测微生物方法中的应用。图2显示了ATP标准曲线。Y轴是RLU(相对光单位)，而X轴是ATP摩尔浓度。实心菱形表示1∶625酶，实心方形表示1∶9酶，而实心三角形表示1∶1酶。图3显示了对P.damnosus的捕集(entrapment)浓度曲线。Y轴是总RLU，而X轴是细胞数。实心菱形是对于137099-1，而实心方形是对于03709本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于由样品混合物中回收微生物的方法，其包括以下步骤： （ｉ）使所述样品混合物由过滤装置的样品入口通过，该过滤装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，所述膜具有第一和第二端部、外表面和限定空腔的内表面，各所述膜的第一端部是开口的而且与所述样品入口连通，由第二端部出来的流体被限制住，使所述样品由所述膜中过滤，在所述膜的所述空腔中留下过滤物； （ｉｉ）重新悬浮在所述膜中的过滤物；以及 （ｉｉｉ）检测所述过滤物中是否存在任何微生物。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊丽莎白安基南，格雷姆缪尔，
申请(专利权)人：流体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]