马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法，涉及微生物技术领域，本发明专利技术提供的马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，处理病斑组织后，利用玻璃珠均匀涂布于培养平板上，经培养后分离纯化得到单菌株，操作简单，能够有效减少病菌分离过程中被污染的机会，同时，可以减少纯化的次数，节约成本。本发明专利技术提供的马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，取上述单菌落培养为菌液后进行PCR反应并测序，简单易行，减少了现有技术中提取菌株基因组DNA的过程，简化了实验步骤的同时，还节约了分离纯化与鉴定病原菌的成本。

The purification method and molecular identification method of pathogenic fungi of scab of potato

The present invention provides a purification method of identification and molecular isolation of a pathogenic bacteria of potato scab, relates to the technical field of microorganisms, isolation and purification method of potato scab pathogenic bacteria provided by the invention, the lesion tissue after treatment, the use of glass beads evenly coated on the plate culture, purified single strain, cultured after separation operation simple, can effectively reduce the contaminated bacteria in the process of separating the opportunity, at the same time, can reduce the number of cost saving and purification. Molecular identification of pathogenic bacteria of potato scab provided by the invention, the single colony culture for bacteria after PCR reaction and sequencing, simple and easy, reduces the process of extracting genomic DNA in the prior art, simplify the experimental procedures at the same time, but also saves separation and purification and identification of pathogenic bacteria of the cost.

【技术实现步骤摘要】
马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法
本专利技术涉及微生物
，尤其是涉及一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法。
技术介绍
马铃薯疮痂病是一种世界性病害，随着马铃薯种植面积的扩大，其危害程度不断加重，严重影响马铃薯种薯的生产和商品薯的外观和销售价格，已成为马铃薯生产上四大主要病害之一。疮痂病菌主要在马铃薯块茎和匍匐茎上侵染形成病斑，不侵染地上部分。马铃薯块茎在疮痂病原菌侵染后，在块茎组织的病健交接处块茎组织颜色呈现枯黄或半透明症状，在发病初期，在块茎表皮上产生褐色或深褐色小斑点，当条件适宜时病斑呈不规则形状扩大，并产生大量木栓化细胞，使病斑处表皮变粗糙；到后期，块茎表面会形成或深或浅凹凸不平的痂状病斑，发病严重的薯块会造成较大的病斑，严重影响马铃薯的品质。马铃薯块茎发病的严重程度以及病斑的大小和深度因品种的抗性、致病菌种类、环境条件等的不同而不同。研究马铃薯疮痂病的致病病原菌，分析致病菌的多样性及致病机制，可为马铃薯疮痂病的防治提供理论基础。现有的马铃薯疮痂病菌的分离纯化方法采用的是组织分离法，需要连续纯化三次后获得纯链霉菌菌株。对纯化后的链霉菌进行分子鉴定，还需要收集菌体后提取病原菌的总DNA，然后进行PCR扩增，将扩增产物进行测序后进行序列比对。目前的分离纯化方法需要约15天的时间，还会增加实验操作过程中的污染问题；另外，在获得单菌落后进行分子鉴定过程中需要提取菌株的DNA，提取的过程也比较复杂费时，因此整个分离纯化与分子鉴定的过程比较漫长，导致病原菌鉴定过程缓慢，影响下一步的试验进度。因此，开发一种成本低，耗时短，操作简单的马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定的方法尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，本专利技术的第二个目的在于提供一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，以缓解现有技术中存在的耗时长、成本高、操作复杂易导致污染的技术问题。本专利技术提供的一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括：取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织，经预处理后得预处理混合物，将所述预处理混合物利用玻璃珠涂布于培养平板上，经培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成所述马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。进一步地，所述病斑组织为去除所述马铃薯疮痂病病斑表层后的组织。进一步地，所述预处理的方法为：将所述病斑组织消毒后研磨并离心。进一步地，所述预处理混合物为上清液。进一步地，在取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织前，还包括所述马铃薯疮痂病病薯的前处理。进一步地，所述前处理的方法为：将所述马铃薯疮痂病病薯用清水洗净后，再用医用酒精消毒，并用ddH2O冲洗，之后将所述马铃薯疮痂病病薯进行干燥处理。另外，本专利技术还提供了一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，所述分子鉴定方法包括：取应用上述的分离纯化方法得到的马铃薯疮痂病病原菌单菌落，于液体培养基中培养为菌液后，取所述菌液进行PCR反应，并利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，将所述扩增结果条带与目的条带相符的扩增产物进行测序，得到测序结果；将所述测序结果在数据库中进行序列比对，鉴定所述单菌落是否为马铃薯疮痂病病原菌。进一步地，所述PCR反应为进行16SrDNA序列扩增；所述扩增的引物为：PrimerF:5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′(SEQIDNO.1)PrimerR:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′(SEQIDNO.2)。进一步地，在所述测序之前，还包括将所述与目的条带相符的扩增条带回收目的基因片段并连接至克隆载体上，得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，涂布抗性平板，进行鉴定；对鉴定为阳性的菌落进行测序，得到测序结果。进一步地，所述马铃薯疮痂病病原菌为链霉菌。本专利技术提供的马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，处理病斑组织后，利用玻璃珠均匀涂布于培养平板上，经培养后分离纯化得到单菌株。该分离纯化方法操作简单，能够有效减少病菌分离过程中被污染的机会，同时，可以减少纯化的次数，节约成本。本专利技术提供的马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，取上述单菌落培养为菌液后进行PCR反应并测序，鉴定所述单菌落是否为马铃薯疮痂病病原菌。该分子鉴定方法简单易行，减少了现有技术中提取菌株基因组DNA的过程，简化了实验步骤的同时，还节约了分离纯化与鉴定病原菌的成本。本专利技术利用疮痂病菌的致病特性、生物学特点及其遗传特点，提供了一种快速、低成本分离鉴定病原菌的行之有效的方法，提高了分离鉴定病原菌种类效率。附图说明图1为本专利技术实施例2提供的PCR电泳结果图；图2为本专利技术实施例2提供的测序结果在BLAST数据库中进行序列比对结果图；图3为本专利技术实施例2提供的测序结果在NCBI数据库中进行序列比对结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，包括：取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织，经预处理后得预处理混合物，将预处理混合物利用玻璃珠均匀涂布于培养平板上，经培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。在本专利技术中，病斑组织为去除所述马铃薯疮痂病病斑表层后的组织。其中，病斑组织的长和宽约1cm，厚度约1-2mm。在本专利技术中，预处理的方法为：将病斑组织消毒后研磨并离心。其中，消毒的方法为：将病斑组织放在75％的医用酒精中浸泡后，用无菌ddH2O冲洗。在一个优选的实施方式中，在75％的医用酒精中浸泡的时间为30s，用无菌ddH2O冲洗的次数为3次。其中，研磨的方法为：将病斑组织放在灭菌的EP管中，加入150-500μL无菌ddH2O后，将病斑组织切碎，用无菌研磨棒进行充分的研磨。在一个优选的实施方式中，灭菌的EP管为1.5mLEP管；加入的无菌ddH2O体积例如可以为，但不限于150μL、200μL、300μL、400μL或500μL。在一个更优选的实施方式中，加入的无菌ddH2O体积为200μL。其中，离心的条件为：室温条件下，5000rpm离心10s。在本专利技术中，预处理混合物为上清液。其中，上清液在涂布前还包括稀释处理，稀释的方法为：取50μL上清液，稀释4倍。在本专利技术中，培养的方法包括：将涂有预处理混合物的培养平板封口后进行培养，得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落；取单菌落划线于新的培养平板上，经一次纯化培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。其中，培养平板为OMA平板；培养的条件为：放置于28℃培养箱中，倒置培养2.5-3.5d；新的培养平板为OMA平板或ISPII培养平板。在本专利技术中，在取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织前，还包括马铃薯疮痂病病薯的前处理。其中，前处理的方法为：将马铃薯疮痂病病薯用清水洗净后，再用75％医用酒精消毒30s，并用ddH2O冲洗，之后将马铃薯疮痂病病薯进行干燥处理。另外，本专利技术还提供了一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，包括：取上述的单菌落，于液体培养基中培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括：取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织，经预处理后得预处理混合物，将所述预处理混合物利用玻璃珠涂布于培养平板上，经培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成所述马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括：取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织，经预处理后得预处理混合物，将所述预处理混合物利用玻璃珠涂布于培养平板上，经培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成所述马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述病斑组织为去除所述马铃薯疮痂病病斑表层后的组织。3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述预处理的方法为：将所述病斑组织消毒后研磨并离心。4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述预处理混合物为上清液。5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织前，还包括所述马铃薯疮痂病病薯的前处理。6.根据权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述前处理的方法为：将所述马铃薯疮痂病病薯用清水洗净后，再用医用酒精消毒，并用ddH2O冲洗，之后将所述马铃薯疮痂病病薯进行干燥处理。7.一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，其特征在于，所述分子鉴定方法包括：取应用权利要求1-6任一项所述的分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王甄，沈艳芬，肖春芳，高剑华，陈巧玲，
申请(专利权)人：恩施土家族苗族自治州农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42