一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种采用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的方法，这个抗体为今后检测人KIAA0100蛋白的表达，研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础。我们使用本发明专利技术中所制备的抗体，采用western blot分析方法检测了U937细胞中人KIAA0100蛋白的表达；采用免疫细胞化学分析方法在世界上首次明确了人KIAA0100蛋白在U937细胞中的亚细胞定位。结果显示：人KIAA0100基因在U937细胞中有两个分子量分别为254kDa和＜250kDa的蛋白产物；在一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白主要定位在细胞膜上，在另一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质。综上所述，本发明专利技术制备的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体能够高效、特异地识别人KIAA0100蛋白。

Preparation of a mouse monoclonal antibody against human KIAA0100 protein

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
使用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体技术是由Milstein和Kohler在1975年首先创立的，目前采用该技术制备的单克隆抗体已经被广泛地应用于生物学和疾病的诊断和治疗等领域。单克隆抗体可以用来检测抗原蛋白的表达，分析抗原蛋白的结构、检测抗原抗体之间的结构关系等。淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理是将骨髓瘤细胞和经抗原诱导产生的能分泌特定抗体的B细胞利用聚乙二醇等细胞融合剂(或者电融合、激光融合)在体外进行细胞融合，筛选并建立能稳定分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这样制备出的杂交瘤细胞同时具有两种亲本细胞的特性，即肿瘤细胞的无限增殖能力及淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有纯度高、效价高、均质性好、重复性好、便于大量生产和进行质量控制等明显优势。人KIAA0100基因是KIAA基因家族的一员，KIAA基因家族是由Kazusa基因研究中心主要从急性髓系白血病细胞系KG-1cDNA文库中获得的一大类编码大蛋白的基因。目前，人KIAA0100基因的功能尚未明确。因为缺乏高效、特异的抗体，无法进行人KIAA0100蛋白表达的研究，无法明确人KIAA0100蛋白的亚细胞定位，也阻碍了其生物学功能的研究。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种采用淋巴细胞杂交瘤技术制备高效、特异的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的方法,为检测KIAA0100蛋白的表达，研究KIAA0100蛋白的结构和功能奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)：使用生物信息学软件OptimumTMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)对人KIAA0100蛋白的蛋白片段(1557-2234)进行分析，将其对应的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子进行优化，在优化后的核苷酸序列的3′端加上6×组氨酸(histidine，His)标签，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a载体中，构建pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒表达载体；步骤(2)：pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒在大肠杆菌中经诱导表达，获得重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)后,使用Ni2+-IDA亲和层析柱纯化；步骤(3)：使用经浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)作为免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，取成功免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)的血清做为阴性对照，使用间接酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)筛选杂交瘤细胞株，使用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行2轮亚克隆，将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，最终得到一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；步骤(4)：使用SBA小鼠单克隆抗体分析试剂盒(SouthernBiotech，伯明翰,美国)检测小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型，使用westernblot分析和免疫细胞化学分析对小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定；步骤(5)：选择3只健康BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)，每只小鼠腹腔注射0.5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)(NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM，PH7.2-7.4)悬浮细胞，使细胞浓度为5×106个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A亲和层析柱纯化。优选的是，重组蛋白抗原的氨基酸序列为SEQIDNO:1。上述任一方案优选的是，密码子优化后的核苷酸序列为SEQIDNO:2。上述任一方案优选的是，人KIAA0100蛋白的蛋白片段为1557位氨基酸-2234位氨基酸蛋白片段，pET30a-KIAA0100表达载体为pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体。上述任一方案优选的是，pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(sopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，使用Ni2+-IDA亲和层析柱对获得的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)进行纯化。上述任一方案优选的是，pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，使用含卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行PCR验证，提取阳性克隆质粒后进行酶切和测序鉴定。上述任一方案优选的是，步骤(2)中具体纯化方法为：取1支15ml离心管，将表达正常的菌种以0.1％比例接种于含100μg/ml卡那霉素的4mlLB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养16小时至18小时后，按1％比例接种至400ml含100μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养至OD600nm＝1.2时，加入终浓度为0.5mMIPTG,15℃、190rpm恒温震荡培养16小时后，用500ml离心杯收集菌体，8,000rpm，离心5分钟后，弃上清，加入120ml缓冲液A(50mMTris-Hcl,300mMNacl,5％甘油,PH8.0)重悬后，加入终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶、0.1ng/ml的核酸酶和2mM的二硫苏糖醇,置于冰水容器中，超声破菌30分钟(超声：3秒，间隔：6秒，功率：600w)后，4℃，13，000rpm离心30分钟后收集上清和沉淀，将得到的上清经Ni2+-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析；将得到的沉淀用洗涤缓冲液(100mMTris-Hcl,300mMNacl,10mM乙二胺四乙酸,2％聚乙二醇辛基苯基醚,2mM二硫苏糖醇,PH8.0)洗涤后，用含8M尿素的洗脱缓冲液(8M尿素，5mMTris-Hcl,300mMNacl,PH8.0)溶解包涵体，经Ni2+-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析和westernblot分析。上述任一方案优选的是，步骤(3)中重组人KIAA0100蛋白片段经浓缩和复性的方法为：将经洗脱缓冲液(8M尿素，5mMTris-Hcl,150mMNac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：使用生物信息学软件Optimum

【技术特征摘要】
1.一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：使用生物信息学软件OptimumTMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)对人KIAA0100蛋白的蛋白片段(1557-2234)进行分析，将其对应的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子进行优化，在优化后的核苷酸序列的3′端加上6×组氨酸(histidine，His)标签，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a载体中，构建pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒表达载体；步骤(2)：pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒在大肠杆菌中经诱导表达，获得重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)后,使用镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+chargedIminodiaceticAcidcolumn，Ni2+-IDA)亲和层析柱纯化；步骤(3)：使用经浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)作为免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，取成功免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)的血清做为阴性对照，使用间接酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)筛选杂交瘤细胞株，使用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行2轮亚克隆，将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，最终得到一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；步骤(4)：使用SBA小鼠单克隆抗体分析试剂盒(SouthernBiotech，伯明翰,美国)检测获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型，使用westernblot分析和免疫细胞化学分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定；步骤(5)：选择3只健康BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)，每只小鼠腹腔注射0.5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)(NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM，PH7.2-7.4)悬浮细胞，使细胞浓度为5×106个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A亲和层析柱纯化。2.根据权力要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，重组蛋白抗原的氨基酸序列为SEQIDNO:1。3.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：密码子优化后的核苷酸序列为SEQIDNO:2。4.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：人KIAA0100蛋白的蛋白片段为1557位氨基酸-2234位氨基酸蛋白片段，pET30a-KIAA0100表达载体为pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体。5.根据权利要求4所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(sopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，使用Ni2+-IDA亲和层析柱对获得的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)进行纯化。6.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：张王刚，崔鹤，蒙昕，古流芳，高洁，刘宇宏，
申请(专利权)人：西安交通大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：陕西,61