一种反应‑顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法技术

本发明专利技术属于分析检测技术领域，公开了一种反应‑顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法。配置一定浓度梯度的氨基酸标准溶液，然后加入过量的茚三酮溶液，设定50～95℃的温度反应0.5～2h，产生的二氧化碳用气相色谱测量，以二氧化碳信号值和氨基酸的浓度关系绘制标准曲线；然后将氨基酸待测样品溶液稀释后，加入与标准曲线绘制相同量的茚三酮溶液，并设定相同的反应温度和时间，产生的二氧化碳用气相色谱测量，所得二氧化碳信号值通过标准曲线得到相应的氨基酸的浓度，再乘以稀释倍数得到待测样品中氨基酸的浓度。本发明专利技术检测方法操作简便，精确度高。相比茚三酮比色法提高了方法的可操作性，缩短了批量样品的分析检测时间。

A method of reaction headspace gas chromatographic determination of amino acid content

The invention belongs to the technical field of detection, and discloses a method for reaction headspace gas chromatographic determination of amino acid content. The allocation of a certain concentration gradient of standard amino acid solution, then adding an excess of three indene ketone solution, reaction temperature setting 50 ~ 95 DEG C for 0.5 ~ 2H, the carbon dioxide produced by gas chromatography using carbon dioxide concentration measurement, relationship between signal value and amino acid standard curve; then the amino acid sample was diluted, indene three ketone solution into the standard curve with the same amount, and set the same reaction time and temperature, the carbon dioxide produced by gas chromatography measurements, the signal value of the corresponding carbon dioxide concentration of amino acids by standard curve, get the amino acid concentration in the samples tested multiplied by the dilution factor. The detection method of the invention is easy to operate and has high accuracy. Compared with the colorimetric method of the nimone three ketone, the maneuverability of the method is improved, and the analysis and detection time of the batch sample is shortened.

【技术实现步骤摘要】
一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法
本专利技术属于分析检测
，具体涉及一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法。
技术介绍
赖氨酸是人体必需的氨基酸之一。也是仅有的三种碱性氨基酸之一，常用作食品添加剂和饲料添加剂，高纯度的赖氨酸在医药行业也有应用。目前人工合成赖氨酸主要采用生物发酵法，产品的形式为赖氨酸盐酸盐或者硫酸盐。赖氨酸的分析方法非常多，如：液相色谱法、高氯酸非水滴定法和甲醛滴定法等。由于色谱法操作复杂，包括氨基酸的柱前衍生化或者柱后衍生化处理，以实现待分析物质能够被荧光光谱或者紫外光谱检测。基于色谱分离的方法，包括高效液相色谱和氨基酸分析仪和阳离子交换树脂法，检测成本高，样品分析时间长。高氯酸非水滴定法使用毒性溶剂，溶剂的排放污染环境。甲醛滴定法以酚酞为指示剂，根据滴定终点碱的消耗量来计算赖氨酸，误差很大。除此之外，茚三酮光谱法广泛用于具有α-氨基基团的氨基酸，如L-赖氨酸，甘氨酸，丙氨酸等的分析检测，其反应原理如图1所示。茚三酮是一种氧化能力强的物质，它氧化氨基酸的α-氨基，自身还原为还原型茚三酮，而氨基酸的氨基氧化为亚氨基，同时分解产生二氧化碳和少一个碳的醛基。在该方法中茚三酮大大过量氨基酸(茚三酮/氨基酸的摩尔比大于30)，它与还原茚三酮，氨水在95°C反应一段时间生成蓝紫色化合物---茚二酮胺。很明显，铵根离子或者有机胺的存在会影响显色物质的生成，带来干扰；另一方面，该显色反应受pH影响很大，不同的pH条件下生成物的颜色差异较大；需要大比例的稀释倍数来满足吸光值能被测试的要求(A低于1.2，测试较为准确)，反应时间的长短也影响颜色的重现性。可见，上述这些不足限制了茚三酮比色法的应用，特别是在一些对精度要求很高的场合。因此，必须探索一种快速、高效的、准确的检验方法，以满足赖氨酸等氨基酸检测的需要。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法，包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：配置一定浓度梯度的氨基酸标准溶液于顶空瓶，然后加入过量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘，设定50～95℃的温度反应0.5～2h，产生的二氧化碳用气相色谱测量，以二氧化碳信号值(二氧化碳的峰面积)和氨基酸的浓度关系绘制标准曲线；(2)将氨基酸待测样品溶液稀释至测定范围之内，加入与标准曲线绘制相同量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘，设定与绘制标准曲线相同的反应温度和时间，产生的二氧化碳用气相色谱测量，所得二氧化碳信号值通过步骤(1)的标准曲线得到相应的氨基酸的浓度，再乘以稀释倍数得到待测样品中氨基酸的浓度。本专利技术方法适用于所有能用茚三酮光谱法进行检测的氨基酸。优选地，所述的氨基酸是指赖氨酸或丙氨酸。优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述反应的温度为60℃，反应时间为1h。过高的反应温度和过长的反应时间会带来茚三酮和中间产物继续反应，产生过量二氧化碳。当二氧化碳产率范围为95％～105％，保证测定的准确性和重现性。上述方法中，所述过量的茚三酮优选为茚三酮/氨基酸的摩尔比大于15。以保证茚三酮和氨基酸的完全反应，使二氧化碳的产率大于95％。为了防止缓冲溶液(高温下分解产生二氧化碳)的干扰，优选地，所述氨基酸标准溶液和氨基酸待测样品溶液均用磷酸盐缓冲溶液，茚三酮和氨基酸的反应适宜pH范围较宽，考虑到二氧化碳的快速溢出，pH值为4.2时最优。优选地，所述茚三酮溶液是指茚三酮的乙醇溶液、乙二醇单甲醚溶液或者乙二醇单乙醚溶液。优选地，所述气相色谱测量条件如下：热导池检测器(TCD)，载气为氮气，流速为2.7mL/min，压力为30psi，后进样口温度200℃，毛细管柱温105℃，分流比0.1，检测时间3min。本测定方法的原理为：根据茚三酮和氨基酸的化学反应原理，有定量二氧化碳生成，利用气相色谱检测生成的二氧化碳，从而得出待测样品中氨基酸的浓度。本专利技术的方法具有如下优点及有益效果：(1)本专利技术检测方法操作简便，精确度高。尤其是克服了茚三酮比色法大比例稀释，反应温度高(95℃)，茚三酮添加量高(相对于氨基酸)及必须冷却等繁琐复杂的步骤。因此，提高了方法的可操作性。(2)本专利技术检测方法特别适用于批量处理大量的样品(样品数大于7)，使单个样品分析检测时间缩短到10min。(3)本专利技术的方法可通过优化茚三酮添加量，反应温度，缓冲液pH和平衡反应时间，确保茚三酮和氨基酸反应产生的二氧化碳产率大于95％，有效的提高了检测的精确度和重现性。附图说明图1为现有茚三酮光谱法用于L-赖氨酸的分析检测的反应原理图；图2为本专利技术实施例中所使用的顶空瓶(内置有玻璃管)的结构示意图；图3为本专利技术实施例中二氧化碳信号值的出峰位置色谱图；图4为本专利技术实施例1中所得二氧化碳信号值和赖氨酸的浓度关系的标准曲线图；图5为本专利技术实施例4中所得二氧化碳信号值和丙氨酸的浓度关系的标准曲线图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。以下实施例所使用的仪器设备及试剂：自动顶空取样器(ThermoHSTriPlus300,US)，安捷伦7890A气相色谱仪(热导池检测器，GS-Q型毛细管色谱柱，长30m，内径0.32mm)，顶空瓶，蓝白色硅胶隔垫(含铁盖)。使用试剂为赖氨酸，茚三酮，乙醇，磷酸二氢钾，盐酸，氢氧化钠，丙氨酸。实施例1(1)配制0.01mol/L的赖氨酸母液，用移液枪分别移取0mL、0.5mL、0.8mL、1.1mL、1.4mL、1.7mL母液到五个顶空瓶中(内置有1ml玻璃管，见图2)，然后加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH4.2)，再将0.5mL茚三酮溶液(0.3mol/L的乙醇溶液)加入到顶空瓶的内置玻璃管中，并补足纯水使顶空瓶内的液体总体积为4.5mL，立即盖好铁盖，上下摇匀，置于自动顶空取样器上，设定OVEN温度60℃，反应时间1h，其产生的二氧化碳用气相色谱来检测。检测条件如下：热导池检测器(TCD)，载气为氮气，流速为2.7mL/min，压力为30psi，后进样口温度200℃，毛细管柱温105℃，分流比0.1，检测时间3min。以二氧化碳信号值(二氧化碳的峰面积，其出现位置如图3色谱图所示，对应的出峰时间为1.95min)和顶空瓶中赖氨酸的浓度关系绘制标准曲线，结果如图4。由图4可知，二氧化碳信号值与赖氨酸浓度具有良好的线性关系。(2)取含赖氨酸待测样品水溶液，稀释10～20倍(取决于其浓度的估计值)，取1mL到顶空瓶中，加入和步骤(1)标准曲线绘制中同样体积的茚三酮溶液、磷酸盐缓冲溶液和所需的纯水，使总体积为4.5mL，盖上顶空瓶，旋紧。上下摇晃均匀。将顶空瓶置于顶空-气相色谱的取样架上，设定与步骤(1)相同的温度和反应时间(平衡时间)，在顶空装置的OVEN中进行原位反应，产生的二氧化碳，立即用气相色谱测量。记录气相色谱图中二氧化碳的峰面积(在停留时间1.95min出现的峰面积)，通过赖氨酸标准曲线的数学关系式，得到稀释后赖氨酸样品溶液中赖氨酸的摩尔浓度，最后乘以相应的稀释倍数，得到待测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反应‑顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：配置一定浓度梯度的氨基酸标准溶液于顶空瓶，然后加入过量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘上，设定50～95℃的温度反应0.5～2h，产生的二氧化碳用气相色谱测量，以二氧化碳信号值和氨基酸的浓度关系绘制标准曲线；(2)将氨基酸待测样品溶液稀释至测定范围之内，加入与标准曲线绘制相同量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘上，设定与绘制标准曲线相同的反应温度和时间，产生的二氧化碳用气相色谱测量，所得二氧化碳信号值通过步骤(1)的标准曲线得到相应的氨基酸的浓度，再乘以稀释倍数得到待测样品中氨基酸的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：配置一定浓度梯度的氨基酸标准溶液于顶空瓶，然后加入过量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘上，设定50～95℃的温度反应0.5～2h，产生的二氧化碳用气相色谱测量，以二氧化碳信号值和氨基酸的浓度关系绘制标准曲线；(2)将氨基酸待测样品溶液稀释至测定范围之内，加入与标准曲线绘制相同量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘上，设定与绘制标准曲线相同的反应温度和时间，产生的二氧化碳用气相色谱测量，所得二氧化碳信号值通过步骤(1)的标准曲线得到相应的氨基酸的浓度，再乘以稀释倍数得到待测样品中氨基酸的浓度。2.根据权利要求1所述的一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法，其特征在于：所述的氨基酸适应于所有能用茚三酮光谱法检测的氨基酸，包括赖氨酸或丙氨酸。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：万小芳，余腾，柴欣生，李友明，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44